Platsstyrd mutagenes

Platsstyrd mutagenes ( platsstyrd mutagenes eller oligonukleotidriktad mutagenes ) är en  molekylärbiologisk teknik som används för att skapa specifika och avsiktliga förändringar i DNA-sekvensen , genen och genprodukterna. Används för att undersöka strukturen och den biologiska aktiviteten hos DNA, RNA och proteiner , och för proteinteknik .

Platsstyrd mutagenes är en av de viktigaste laboratoriemetoderna för att införa mutationer i en DNA-sekvens. Det finns många sätt att uppnå platsriktad mutagenes, men på grund av de minskande kostnaderna för oligonukleotidsyntes används nu ibland konstgjord gensyntes som ett alternativ till platsriktad mutagenes. Sedan 2013 har utvecklingen av CRISPR / Cas9-teknologi baserad på ett prokaryotiskt antiviralt system tillåtit genomredigering , och mutagenes kan utföras relativt enkelt in vivo [1] .

Historik

Tidiga försök till mutagenes med användning av strålning eller kemiska mutagener var icke-platsspecifika och resulterade i slumpmässiga mutationer. Nukleotidanaloger och andra kemikalier användes därefter för att skapa lokala punktmutationer, såsom aminopurin , nitrosoguanidin och bisulfit . Platsstyrd mutagenes användes först 1974 i Charles Weissmans laboratorium. Nukleotidanalogen N-4-hydroxicytidin användes, vilket inducerar övergången från GC till AT. Dessa mutagenesmetoder var emellertid begränsade till typen av mutation och var inte lika specifika som senare platsriktade mutagenesmetoder.

1971 visade Clyde Hutchison och Marshall Edgell att det var möjligt att producera mutanter med små fragment av φX174-fagen och restriktionsnukleaser. Hutchinson utvecklade senare en mer flexibel platsstyrd mutagenesmetod med användning av oligonukleotider i en DNA-polymerasförlängningsmetod med sin samarbetspartner Michael Smith 1978 . Michael Smith delade senare Nobelpriset i kemi i oktober 1993 med Kary Mullis , som uppfann polymeraskedjereaktionen .

Den grundläggande proceduren kräver syntes av en kort DNA- primer . Denna syntetiska primer innehåller den önskade mutationen och är komplementär till mall-DNA runt platsen för den framtida mutationen så att den kan hybridisera till DNA i genomet. En mutation kan vara en enda basförändring ( punktmutation ), en multipel basförändring, en deletion eller en insättning . Den enkelsträngade primern förlängs sedan med ett DNA-polymeras som kopierar resten av genen. Således innehåller den replikerade genen ett mutantställe och introduceras sedan i en värdcell som en vektor och klonas. Slutligen selekteras mutanter genom DNA-sekvensering för att säkerställa att de innehåller den önskade mutationen.

Den ursprungliga metoden med användning av enkel primerförlängning var ineffektiv på grund av lågt mutantutbyte. Den resulterande blandningen innehåller både det ursprungliga omuterade provet ( vildtyp ) såväl som den muterade DNA-strängen, vilket bildar en blandad population av mutanter och icke-mutanter. Dessutom är den vilda typen som används i metylerad form, medan i mutanten är strängen ometylerad och mutanterna kan begränsas på grund av felaktig matchning av modifierings-restriktionssystemet, vilket resulterar i färre mutanter. Därför utvecklades metoder därefter för att förbättra effektiviteten av mutagenes.

Metoder

Ett stort antal metoder finns tillgängliga för platsriktad mutagenes, även om de flesta av dem nu sällan används i laboratorier sedan början av 2000-talet, eftersom nya moderna teknologier erbjuder enklare sätt att introducera en mutation på en specifik plats i en gen.

Kunkels metod

1985 tillämpade Thomas Kunkel en metod som gör det lättare att välja mutanter. DNA-fragmentet som ska muteras sätts in i fasmider såsom M13mp18/19 och transformeras sedan till en E. coli- stam som saknar två enzymer, dUTPas (UI) och uracildeglykosylas (UDG). Båda enzymerna är en del av DNA-reparationssystemet som skyddar den bakteriella kromosomen från spontana deamineringsmutationer från dCTP till dUTP. Brist på dUTPase förhindrar förstörelsen av dUTP, vilket resulterar i en hög nivå av dUTP i cellen. En brist på uracil-deglykosylas förhindrar avlägsnande av uracil från nysyntetiserat DNA. Eftersom fag-DNA:t replikerar i E. coli -dubbelmutanten kan dess enzymsystem således felaktigt infoga dUTP istället för dTTP, vilket resulterar i enkelsträngat DNA som innehåller flera uraciler (ssU-DNA). SsU-DNA extraheras sedan från bakteriofagen som frisätts i mediet och sedan används som mall för mutagenes. En oligonukleotid innehållande den önskade mutationen används för att förlänga primern. Den resulterande DNA-heteroduplexen består av en icke-mutant modersträng innehållande dUTP och en mutantsträng innehållande dTTP. DNA:t transformeras sedan till en E. coli-stam som bär vildtyps-IU- och UDG-gener. Den uracil-innehållande moder-DNA-strängen bryts sedan ned, så att nästan allt erhållet DNA består av den muterade strängen.

Kassettmutagenes

Till skillnad från andra metoder kan kassettmutagenes inte involvera primerförlängning med användning av DNA-polymeras. I denna metod syntetiseras ett DNA-fragment och sätts sedan in i en plasmid. Det involverar digestion med ett restriktionsenzym vid ett ställe i plasmiden och efterföljande ligering av ett par komplementära oligonukleotider som innehåller en mutation i genen av intresse i plasmiden. Vanligtvis är restriktionsenzymerna som skär plasmiden och oligonukleotiden desamma, vilket ger plasmiden klibbiga ändar och inlägg att ligera till varandra. Denna metod kan producera mutanter nära till 100 % effektiva, men är begränsad av närvaron av lämpliga restriktionsställen som flankerar platsen som ska muteras.

PCR platsriktad mutagenes

Det begränsade antalet restriktionsställen i kassettmutagenes kan övervinnas genom polymeraskedjereaktion med oligonukleotid-"primers" så att ett större fragment kan bildas som spänner över två lämpliga restriktionsställen. Exponentiell PCR-amplifiering ger ett fragment som innehåller den önskade mutationen i tillräcklig mängd för att separeras från den ursprungliga, omuterade plasmiden genom gelelektrofores, som sedan kan infogas i det ursprungliga sammanhanget med användning av standardtekniker för rekombinant molekylärbiologi. Det finns många varianter av denna metod. Den enklaste metoden placerar mutationsstället i ena änden av fragmentet, vilket resulterar i en av de två oligonukleotiderna som används för att generera fragmentet som innehåller mutationen. Denna metod inkluderar ett PCR-steg, men har fortfarande problemet att kräva ett lämpligt restriktionsställe nära mutationsstället om inte en mycket lång primer används. Andra varianter använder därför tre eller fyra oligonukleotider, varav två kan vara icke-mutagena oligonukleotider som spänner över två restriktionsställen och ger ett fragment som kan begränsas och ligeras in i en plasmid, medan en mutagen oligonukleotid kan vara komplementär till en plats i detta fragment från vilken lämplig restriktionsplats som helst. Dessa metoder kräver flera PCR-steg så att det slutliga fragmentet som ska ligeras kan innehålla den önskade mutationen. Designprocessen för att generera ett fragment med den önskade mutationen och de lämpliga restriktionsställena kan vara besvärlig. Program som SDM-Assist kan förenkla denna process.

Hel plasmidmutagenes

För plasmidmanipulation har andra platsriktade mutagenestekniker ersatts av metoder som är mycket effektiva, men relativt enkla och lätta att använda, och även kommersiellt tillgängliga som ett kit. Ett exempel på dessa metoder är QuikChange-metoden, där ett par komplementära mutagena primrar används för att amplifiera hela plasmiden i en termocyklisk reaktion med användning av ett högtroget, icke-sträng-förskjutande DNA-polymeras såsom pfu- polymeras . Reaktionen producerar hackat, cirkulärt DNA. Mall-DNA måste elimineras genom enzymatisk digestion med ett restriktionsenzym såsom DpnI , som är specifikt för metylerat DNA . Allt DNA som erhålls från de flesta E. coli-stammar kommer att metyleras; En provplasmid som syntetiseras i E. coli kommer således att vara begränsad, medan en muterad plasmid som genereras in vitro kommer att vara ometylerad och förbli obegränsad. Det bör noteras att i dessa dubbelsträngade plasmidmutagenesmetoder, medan termocyklingsreaktionen kan användas, finns det inget behov av DNA-amplifiering i PCR. Istället är amplifieringen linjär och kan därför inte sägas vara PCR, eftersom det inte är någon kedjereaktion inblandad.

Det bör noteras att pfu- polymeraset kan bli kedjeförskjutande vid en högre förlängningstemperatur (≥70°C), vilket kan leda till experimentfel, så ejlogneringsreaktionen bör utföras vid den rekommenderade temperaturen på 68°C. I vissa tillämpningar resulterar denna metod i införandet av flera kopior av primers. En variant av denna metod, kallad SPRINP, förhindrar denna artefakt och har använts i olika typer av platsstyrd mutagenes.

Platsstyrd mutagenes in vivo

CRISPR

Sedan 2013 har utvecklingen av CRISPR/Cas9-teknologin gjort det möjligt att effektivt introducera punktmutationer i genomet hos en mängd olika organismer. Metoden kräver inte insättning av ett transposonställe , lämnar ingen markör, och dess effektivitet och enkelhet har gjort den till den föredragna metoden för genomredigering.

Applikation

Platsstyrd mutagenes används för att generera mutationer som kan producera ett rationellt utformat protein som har förbättrade eller speciella egenskaper (proteinteknik).

Forskningsverktyg  - specifika mutationer i DNA som låter dig utforska funktionerna och egenskaperna hos en DNA- eller proteinsekvens på ett rationellt sätt. Dessutom kan enstaka aminosyraförändringar genom platsriktad mutagenes i proteiner hjälpa till att förstå vikten av posttranslationella modifieringar. Om man till exempel byter ett visst serin (fosfoacceptor) till alanin (en fosfo-icke-acceptor) i ett proteinsubstrat blockerar den bundna fosfatgruppen, vilket gör att fosforylering kan undersökas. Detta tillvägagångssätt har använts för att avslöja fosforyleringen av CBP -proteinet av HIPK2 -kinaset .

Kommersiella applikationer  - Proteiner kan utformas för att producera muterade former som är skräddarsydda för en viss applikation. Till exempel kan vanligt använda tvättmedel innehålla subtilisin , som har vildtypsmetionin , som kan oxideras med blekmedel, vilket kraftigt minskar proteinaktiviteten i processen. Detta metionin kan ersättas med alanin eller andra rester, vilket gör det resistent mot oxidation, vilket håller proteinet aktivt i närvaro av blekmedel.

Gensyntes

Eftersom kostnaden för att syntetisera DNA-oligonukleotider sjunker, är artificiell helgensyntes för närvarande en gångbar metod för att introducera mutation i en gen. Denna metod tillåter omfattande mutagenes av många platser, inklusive den fullständiga omdesignen av en gens kodonanvändning för att optimera den för en viss organism.

Se även

Anteckningar

  1. ↑ Hsu PD, Lander ES, Zhang F (juni 2014). "Utveckling och tillämpningar av CRISPR-Cas9 för genomteknik" . cell . 157 (6): 1262-78. DOI : 10.1016/j.cell.2014.05.010 . PMC  4343198 . PMID24906146  . _

Länkar

  Gå till Wikidata-objektet  Ordböcker och uppslagsverk