Semesterstruktur

Holliday struktur [1] ( eng.  Holliday junction ) är en struktur av fyra kedjor av nukleinsyror anslutna till varandra genom vätebindningar för att bilda fyra dubbelsträngade grenar. Dessa grenar kan anta flera olika konformationer beroende på koncentrationen av salter i den omgivande buffertlösningen och sekvensen av nukleotider som är belägna i omedelbar närhet av korsningen. Strukturen är uppkallad efter den engelske molekylärbiologen Robin Holliday , som föreslog att den skulle existera 1964.

I levande celler är Holliday-strukturer viktiga mellanprodukter som uppstår under processerna för genetisk rekombination och reparation av dubbelsträngsbrott. Som regel har dessa strukturer symmetriska nukleotidsekvenser och har därför viss rörlighet, det vill säga individuella dubbelsträngade grenar kan glida samtidigt som strukturen för kopplingen och mönstret för kvävebasparning bibehålls . Fyrsträngsstrukturer som liknar Hollidays finns också i vissa RNA- molekyler .

Fasta Holliday-strukturer med asymmetriska sekvenser som fixerar strukturen i en strikt definierad position skapades artificiellt för att studera deras struktur som en modell av naturliga Holliday-strukturer. Senare fann sådana strukturer användning som de grundläggande byggstenarna i DNA-nanoteknik : flera Holliday-strukturer kan sättas samman till en enda struktur med en specifik geometri, vilket bildar molekyler med en hög grad av strukturell styvhet.

Struktur

Holliday-strukturer kan existera som olika konformationella isomerer (konformers) som skiljer sig åt i sättet för koaxial stapling mellan de fyra dubbelsträngade grenarna. Koaxial stapling är benägenheten hos trubbiga ändar i nukleinsyrastrukturer att binda till varandra genom att binda exponerade kvävehaltiga baser. Det finns tre olika staplingskonformer : en form utan koaxial stapling och två former med koaxial stapling. Den icke-staplingsformen dominerar i frånvaro av tvåvärda metallkatjoner , såsom Mg2 + , på grund av den elektrostatiska repulsionen av negativt laddade kedjeryggrader. I närvaro av minst 0,1 mM Mg 2+ neutraliseras elektrostatisk repulsion och staplingsstrukturer dominerar [2] .

Former som saknar stapling har en nästan platt kvadratisk struktur. Staplade konformer består av två dubbelsträngade domäner arrangerade i en vinkel på 60° enligt högerhandsregeln . Två av de fyra kedjorna (en från varje domän) behåller den spiralformade strukturen, medan de andra två passerar från en domän till en annan på ett antiparallellt sätt [2] .

De två möjliga staplade konformatorerna skiljer sig åt i vilka strängar staplingen sker på. Övervägandet av en av formerna bestäms till stor del av den specifika sekvensen av nukleotider nära föreningspunkten. Vissa av dessa sekvenser är sådana att de två konformatorerna är i jämvikt med varandra, medan andra sekvenser bestämmer den uttalade dominansen av en av konformerna. Sålunda, i Holliday-föreningar, där A-CC-sekvensen är belägen vid korsningen av fyra kedjor, dominerar konformatorn som tillåter bildandet av vätebindningar mellan det andra cytosinet och ett av fosfaterna vid korsningen [2] .

I Holliday-korsningar med symmetriska sekvenser kan anslutningspunkten för de fyra kedjorna (grenpunkten) röra sig längs slumpmässiga gångmodellen . Grenpunktens rörelsehastighet varierar avsevärt beroende på jonkoncentrationen : om i frånvaro av joner var varaktigheten av en förskjutningsakt 0,3–0,4 ms, då var den i närvaro av 10 mM Mg 2+ 270– 300 ms. Hastighetsförändringen är förknippad med bildandet av strukturer med stapling istället för strukturer utan stapling [2] .

Om ett enkelsträngsbrott inträffar i Holliday-övergången, får förbindelsepunkten en vinkelrät orientering och en staplingsform bildas (se figur) [2] .

Holliday-föreningar från RNA antar en antiparallell staplingskonformation vid höga magnesiumkoncentrationer, en vinkelrät staplingskonformation vid medelhöga koncentrationer och en parallell staplingskonformation vid låga koncentrationer; men även vid låga kalciumkoncentrationer antar de en antiparallell struktur [2] .

Biologiska funktioner

Holliday-övergången är en nyckelmellanprodukt som bildas under homolog rekombination , såväl som under platsspecifik rekombination , där integraser deltar . Dessutom bildas det under reparation av dubbelsträngsbrott. Slutligen kan korsformade strukturer, inklusive Holliday-övergångar, bildas för att minska spiralspänningen i symmetriska sekvenser i DNA-superspolar [3] . De fyrsträngade strukturerna som finns i icke-kodande RNA , såsom U1 spliceosomal RNA och tobaksringfläckvirus hårnålsribozym , innehåller vanligtvis oparade nukleotider mellan de dubbelsträngade regionerna och är därför strängt taget. inte Holliday-korsningar [2] .

Under homolog rekombination bildas Holliday-övergångar mellan identiska eller nästan identiska sekvenser, vilket resulterar i strängar arrangerade symmetriskt kring den centrala grenpunkten. Detta gör att processen med grenmigrering kan äga rum , där kedjor rör sig genom korsningen [2] . Klippning eller upplösning av Holliday-strukturen kan utföras på två sätt, varav ett leder till överkorsning , där två rekombinanta strängar bildas, och det andra till genkonvertering , som ett resultat av vilket endast en rekombinant sträng bildas [ 4] .

Många proteiner kan känna igen och förvränga strukturen hos Holliday-övergången. Sådana är till exempel enzymer som kan bryta ned Holliday-föreningar på ett ibland sekvensberoende sätt. Dessa proteiner stör strukturen av Holliday-övergången på olika sätt, ofta omvandlar Holliday-övergången till en icke-staplingskonformation, bryter de centrala basparen och/eller ändrar vinklarna mellan de fyra strängarna. Andra proteiner som känner igen Holliday-kopplingar är grenpunktsproteiner, som ökar rekombinationshastigheten med en storleksordning, såväl som platsspecifika rekombinaser [2] . Hos prokaryoter är enzymerna som löser upp Holliday-föreningar (resolvaser) indelade i två familjer - integraser och nukleaser . Dessa proteiner är strukturellt lika trots avsaknaden av sekvenskonservatism [ 4] .

Hos eukaryoter kan dubbelsträngsbrottsreparation via homolog rekombination ske på två olika sätt: dubbelsträngsbrottsreparation (DSBR), ofta även kallad Hollidays dubbelövergångsmodell, och syntesberoende kedjeförmedling (SDSA) [5] . Med ett dubbelsträngsbrott förstörs 3'-änden av en av kedjorna, och den längre 5'-änden närmar sig en av systerkromatiderna till den andra kromosomen och binder till den; resultatet är en replikeringsbubbla . När "bubblan" närmar sig DNA- brytningen , binder den längre 5'-änden av antisenssträngen till sense-strängen igen. Därefter syntetiseras de saknade DNA-segmenten med hjälp av systerkromatiden från en annan homolog kromosom som mallar. När, i slutet av gapfyllningen, de frånkopplade ändarna av systerkromatiderna går samman, bildas två Holliday-strukturer, som sedan löses upp med hjälp av en mängd olika proteiner [6] .

I bakterier repareras dubbelsträngsbrott i DNA av RecBCD -proteinet genom mekanismen för homolog rekombination. Reparation av enkelsträngsbrott sker i en homolog rekombinationsvariant känd som RecF-vägen . Dessa två vägar (RecBCD och RecF) involverar processer som grenmigrering, där enkelsträngade DNA-fragment utbyts mellan två korsade DNA-molekyler, och upplösning, där de korsade DNA-molekylerna separeras från varandra och återgår till sin normala dubbel-. strandat tillstånd [7] . Hos bakterier underlättas grenmigrering av RuvABC- komplexet och RecG-proteinet, proteinmolekylära motorer som använder energin från ATP -hydrolys för att flytta föreningen. Efter detta bör Holliday-övergången lösas upp i två separata DNA-duplex, vilket returnerar det ursprungliga eller rekombinerade tillståndet. Proteinerna RuvA och RuvB är involverade i kedjemigrering, medan RuvC löser Holliday-övergången [8] [2] .

Homolog rekombination har beskrivits i flera grupper av virus . I DNA-innehållande virus (till exempel herpesvirus ) utförs rekombination längs vägen för bryt-återförening, liknande hur det sker i bakterier och eukaryoter [9] . Det finns bevis för rekombination i RNA-virus , speciellt de som innehåller positivt enkelsträngat RNA [  såsom retrovirus , coronavirus och picornavirus ; situationen med virus som innehåller negativt RNA (till exempel med influensavirus ) är mer kontroversiell [10] .

Tillåter Holliday Connections

I jästen Saccharomyces cerevisiae kan upplösning av Holliday-strukturer ske på fyra olika sätt [11] . Den väg som oftast leder till crossover i jäst och eventuellt däggdjur involverar EXO1 -proteinerna , MLH1 -MLH3 heterodimeren (känd som MutL gamma) och SGS1 ( en ortolog av Blooms syndrom protein ) [11] . MLH1-MLH3 binder övervägande till Holliday-föreningar [12] . Det är ett endonukleas som introducerar enkelsträngsbrott i supercoiled dubbelsträngat DNA och främjar crossover [12] [13] . Medan tre andra vägar som involverar MUS81 -MMS4, SIX1 respektive YEN1 kan bidra till upplösningen av Holliday-korsningar in vivo , minskar frånvaron av dessa tre nukleaser endast obetydligt övergångshastigheten. Dubbla mutanter som saknade både MLH3 och MMS4 visade en signifikant minskning av korsningsfrekvens jämfört med vildtyp ; dock skedde separationen av kromosomer i de flesta fall utan fel, och jästsporers livsduglighet var ganska hög (62%) [14] [14] .

Även om MUS81-proteinet är en komponent i den mindre övergångsvägen under meios i spirande jästsvampar, växter och ryggradsdjur , är det involverat i en nödvändig men inte dominant övergångsväg i ciliatet Tetrahymena thermophila . I fissionsjästen Schizosaccharomyces pombe är MUS81-vägen den dominerande överkorsningsmekanismen [15] .

MSH4- och MSH5-proteinerna bildar en heterodimer hos människor och jäst [16] [17] [18] . I jäst underlättar det korsning mellan homologa kromosomer under meios [16] . MSH4 / MSH5 -komplexet binder och stabiliserar dubbla Holliday-övergångar, vilket underlättar deras upplösning för att bilda rekombinanta kedjor. I S. cerevisiae - mutanter med delvis funktionell MSH4 minskas antalet korsningar per genom med 30 %, och i många fall åtföljs meios inte av rekombination. Men sporerna av denna mutant är livskraftiga, så separationen av homologa kromosomer sker korrekt. Således, i S. cerevisiae , är kromosomsegregation under meios inte helt beroende av korsning [19] .

Användning i DNA-nanoteknik

DNA-nanoteknik är engagerat i utveckling och produktion av konstgjorda nukleinsyror som inte bär genetisk information , som i levande celler, utan fungerar som material för nanoteknik . Förgrenade strukturer av DNA används som elementära enheter för att skapa mer komplexa konstruerade strukturer. Många av dessa DNA-strukturer inkluderar Holliday-föreningar. Enstaka Holliday-fogar är för flexibla för att kunna monteras i långa ordnade rader, därför används konstruktionsmotiv som innehåller flera Holliday-fogar [20] [21] som stela enheter för att montera stora enheter .

Av dessa motiv är det vanligast använda dubbelkorsningskomplexet (DX), som innehåller två Holliday-övergångar placerade nära varandra, vilket resulterar i en stel struktur som kan självmontera till rader av högre ordning. I DX-molekylen är Holliday-föreningarna orienterade så att deras dubbelsträngade områden är sida vid sida snarare än i den mer föredragna 60°-vinkeln. Komplexet kan utformas på ett sådant sätt att anslutningarna är placerade i parallell eller antiparallell orientering, men i praktiken är antiparallell orientering bekvämare, och parallell används sällan [20] [21] .

DX-strukturmotivet är en elementär byggsten i DNA-origamimetoden , som används för att skapa större 2D- och 3D-strukturer i fri form. Sammansättningen av långa förlängda "band" utförs inte från individuella DX-enheter, utan från dubbelsträngade DNA-strängar; dessa trådar viks in i den korrekta formen av hjälpkedjor som bildar Holliday-övergångar som kedjor involverade i crossover [23] .

Några av byggstenarna som används inom DNA-nanotekniken behåller den inneboende 60°-vinkeln hos Holliday-föreningar. Till exempel, i sådana enheter kan 4 Holliday-korsningar bilda ett parallellogram . Denna struktur är intressant eftersom den tillåter direkt visualisering av vinkeln i leden med hjälp av atomkraftsmikroskopi . Block av tre Holliday-föreningar sammansatta i en triangel användes för att skapa tredimensionella periodiska strukturer som används i röntgendiffraktionsanalys av biomolekyler [20] [21] .

Studiens historia

År 1964 föreslog den engelske vetenskapsmannen Robin Holliday (1932–2014) strukturen på föreningen som nu bär hans namn som en del av hans modell för homolog rekombination utvecklad från hans studier av svamparna Ustilago maydis och Saccharomyces cerevisiae . Denna modell beaktade de molekylära mekanismerna för överkorsning och genomvandling. Holliday insåg att under överkorsning av DNA borde heteroduplex med några oparade baser bildas på grund av små skillnader mellan varianter ( alleler ) av en gen . Han föreslog att cellen måste ha en mekanism för att korrigera oparade baser, och en sådan mekanism upptäcktes verkligen [4] . Före Hollidays modell dominerade modellen för selektiv kopiering, enligt vilken en ny sträng syntetiserades direkt från delar av olika modersträngar [24] [25] .

I Hollidays ursprungliga modell bildades heteroduplex-DNA på båda homologa kromosomerna, men experimentella data från jäst motbevisade detta. 1975 uppdaterade Matthew Meselson och Charlie Redding modellen och introducerade idén om kedjemigrering [24] . Ytterligare observationer ledde på 1980-talet till utvecklingen av alternativa rekombinationsmodeller såsom dubbelsträngsbrottsmodellen och strängsträckningsmodellen. Den tredje modellen, modellen för syntesberoende kedjekorrigering, antog inte bildandet av Holliday-föreningar [4] .

Det första experimentella beviset för förekomsten av Holliday-föreningar erhölls i slutet av 1970-talet med hjälp av elektronmikroskopi , där fyrsträngsstrukturer var tydligt synliga i bilder av DNA från plasmider och bakteriofager . På 1980 -talet identifierades enzymer som är ansvariga för att initiera bildandet av Holliday-föreningar och binda till dem. 1983 erhöll Nadrian Seaman för första gången artificiella Holliday-strukturer från syntetiska oligonukleotider , vilket öppnade möjligheter för en mer detaljerad studie av egenskaperna hos Holliday-strukturer. Många av Hollidays tidiga studier av föreningar baserades på metoder som elektrofores , FRET och andra. På 1990 -talet blev kristallografi och NMR av nukleinsyror , såväl som datormetoder för molekylär modellering [2] [4] [26] tillgängliga .

Ursprungligen antog genetiker att Holliday-korsningen mer kännetecknades av en parallell snarare än antiparallell konformation , eftersom de homologa duplexen i detta fall skulle vara belägna närmast varandra. Kemisk analys utförd på 1980-talet visade att den antiparallella konformationen dominerade; dessa uppgifter verkade så motsägelsefulla att Robin Holliday själv först avvisade dem [2] . Därefter fick begreppet antiparallell konformation större acceptans genom in vitro -röntgenmolekylanalysdata . Under in vivo- förhållanden är situationen mindre tydlig, eftersom proteiner som binder till Holliday-föreningar kan ändra sin konformation [4] .

De konceptuella grunderna för användningen av Holliday-föreningar i DNA-nanoteknik lades av Seaman i början av 1980-talet. 1982-1983 utvecklades och skapades Hollidays fasta förbindelser [27] .

Anteckningar

1. ↑ Cellens molekylärbiologi: i 3 volymer / B. Alberts, A. Johnson, D. Lewis et al. - M.-Izhevsk: Research Center "Regular and Chaotic Dynamics", Institutet för datorforskning, 2013. - T. I s. 466-483. — 808 sid. - ISBN 978-5-4344-0112-8 .
2. ↑ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Lilley DM Strukturer av spiralövergångar i nukleinsyror.  (engelska)  // Kvartalsgranskning av biofysik. - 2000. - Vol. 33, nr. 2 . - S. 109-159. — PMID 11131562 .
3. ↑ Bloomfield, Victor A.; Crothers, Donald M.; Tinoco, Jr., Ignacio. Nukleinsyror: strukturer, egenskaper och funktioner  (engelska) . - Sausalito, Kalifornien: University Science Books, 2000. - P. 468. - ISBN 0935702490 .
4. ↑ 1 2 3 4 5 6 Liu Y. , West SC Happy Hollidays: 40-årsdagen av Holliday-korsningen.  (engelska)  // Naturrecensioner. Molekylär cellbiologi. - 2004. - Vol. 5, nr. 11 . - s. 937-944. - doi : 10.1038/nrm1502 . — PMID 15520813 .
5. ↑ Sung P. , Klein H. Mechanism of homologous recombination: mediatorer och helicaser tar på sig reglerande funktioner.  (engelska)  // Naturrecensioner. Molekylär cellbiologi. - 2006. - Vol. 7, nr. 10 . - S. 739-750. - doi : 10.1038/nrm2008 . — PMID 16926856 .
6. ↑ Hartel, Daniel L.; Jones, Elizabeth W. Kapitel 6: Molekylärbiologi för DNA-replikation och rekombination // Genetik: Analys av genetik och genom  (engelska) . — Burlington: Jones & Bartlett, 2009.
7. ↑ Rocha EP , Cornet E. , Michel B. Jämförande och evolutionär analys av de bakteriella homologa rekombinationssystemen.  (engelska)  // PLoS genetik. - 2005. - Vol. 1, nr. 2 . — P. e15. - doi : 10.1371/journal.pgen.0010015 . — PMID 16132081 .
8. ↑ Kowalczykowski SC Initiering av genetisk rekombination och rekombinationsberoende replikation.  (engelska)  // Trender inom biokemiska vetenskaper. - 2000. - Vol. 25, nr. 4 . - S. 156-165. — PMID 10754547 .
9. ↑ Fleischmann Jr, WR Kapitel 43 // Medicinsk mikrobiologi  (neopr.) . — 4:a. - University of Texas Medical Branch i Galveston, 1996. - ISBN 0-9631172-1-1 .
10. ↑ Boni MF , de Jong MD , van Doorn HR , Holmes EC Riktlinjer för identifiering av homologa rekombinationshändelser i influensa A-virus.  (engelska)  // Public Library of Science ONE. - 2010. - Vol. 5, nr. 5 . — P. e10434. - doi : 10.1371/journal.pone.0010434 . — PMID 20454662 .
11. ↑ 1 2 Zakharyevich K. , Tang S. , Ma Y. , Hunter N. Avgränsning av gemensamma molekylupplösningsvägar i meios identifierar en korsningsspecifik resolvas.  (engelska)  // Cell. - 2012. - Vol. 149, nr. 2 . - s. 334-347. - doi : 10.1016/j.cell.2012.03.023 . — PMID 22500800 .
12. ↑ 1 2 Ranjha L. , Anand R. , Cejka P. Saccharomyces cerevisiae Mlh1-Mlh3 heterodimer är ett endonukleas som företrädesvis binder till Holliday junctions.  (engelska)  // The Journal of biological chemistry. - 2014. - Vol. 289, nr. 9 . - P. 5674-5686. - doi : 10.1074/jbc.M113.533810 . — PMID 24443562 .
13. ↑ Rogacheva MV , Manhart CM , Chen C. , Guarne A. , Surtees J. , Alani E. Mlh1-Mlh3, en meiotisk korsning och reparationsfaktor för DNA-felmatchning, är ett Msh2-Msh3-stimulerat endonukleas.  (engelska)  // The Journal of biological chemistry. - 2014. - Vol. 289, nr. 9 . - P. 5664-5673. - doi : 10.1074/jbc.M113.534644 . — PMID 24403070 .
14. ↑ 1 2 Sonntag Brown M. , Lim E. , Chen C. , Nishant KT , Alani E. Genetisk analys av mlh3-mutationer avslöjar interaktioner mellan crossover-främjande faktorer under meios i bagerijäst.  (engelska)  // G3 (Bethesda, Md.). - 2013. - Vol. 3, nr. 1 . - S. 9-22. - doi : 10.1534/g3.112.004622 . — PMID 23316435 .
15. ↑ Lukaszewicz A. , Howard-Till RA , Loidl J. Mus81-nukleas och Sgs1-helikas är väsentliga för meiotisk rekombination i en protist som saknar ett synaptonemalt komplex.  (engelska)  // Nukleinsyraforskning. - 2013. - Vol. 41, nr. 20 . - P. 9296-9309. - doi : 10.1093/nar/gkt703 . — PMID 23935123 .
16. ↑ 1 2 Pochart P. , Woltering D. , Hollingsworth NM Bevarade egenskaper mellan funktionellt distinkta MutS-homologer i jäst.  (engelska)  // The Journal of biological chemistry. - 1997. - Vol. 272, nr. 48 . - P. 30345-30349. — PMID 9374523 .
17. ↑ Winand NJ , Panzer JA , Kolodner R.D. Kloning och karakterisering av human- och Caenorhabditis elegans-homologer av Saccharomyces cerevisiae MSH5-genen.  (engelska)  // Genomics. - 1998. - Vol. 53, nr. 1 . - S. 69-80. - doi : 10.1006/geno.1998.5447 . — PMID 9787078 .
18. ↑ Bocker T. , Barusevicius A. , Snowden T. , Rasio D. , Guerrette S. , Robbins D. , Schmidt C. , Burczak J. , Croce CM , Copeland T. , Kovatich AJ , Fishel R. hMSH5: a human MutS-homolog som bildar en ny heterodimer med hMSH4 och uttrycks under spermatogenes.  (engelska)  // Cancerforskning. - 1999. - Vol. 59, nr. 4 . - s. 816-822. — PMID 10029069 .
19. ↑ Krishnaprasad GN , Anand MT , Lin G. , Tekkedil MM , Steinmetz LM , Nishant KT Variation in crossover frekvenser stör korsningsförsäkran utan att påverka meiotisk kromosomsegregation i Saccharomyces cerevisiae.  (engelska)  // Genetik. - 2015. - Vol. 199, nr. 2 . - s. 399-412. - doi : 10.1534/genetics.114.172320 . — PMID 25467183 .
20. ↑ 1 2 3 Seeman NC Nanotechnology and the double helix.  (engelska)  // Scientific American. - 2004. - Vol. 290, nr. 6 . - S. 64-69. — PMID 15195395 .
21. ↑ 1 2 3 Seeman NC Nanomaterial baserade på DNA.  (engelska)  // Årlig genomgång av biokemi. - 2010. - Vol. 79. - S. 65-87. - doi : 10.1146/annurev-biochem-060308-102244 . — PMID 20222824 .
22. ↑ Pan K. , Kim DN , Zhang F. , Adendorff MR , Yan H. , Bathe M. Gitterfri förutsägelse av tredimensionell struktur hos programmerade DNA-sammansättningar.  (engelska)  // Naturkommunikation. - 2014. - Vol. 5. - P. 5578. - doi : 10.1038/ncomms6578 . — PMID 25470497 .
23. ↑ Saccà B. , Niemeyer CM DNA-origami: konsten att vika DNA.  (engelska)  // Angewandte Chemie (International ed. in English). - 2012. - Vol. 51, nr. 1 . - S. 58-66. - doi : 10.1002/anie.201105846 . — PMID 22162047 .
24. ↑ 1 2 Stahl FW Holliday-korsningen på dess trettioårsjubileum.  (engelska)  // Genetik. - 1994. - Vol. 138, nr. 2 . - S. 241-246. — PMID 7828807 .
25. ↑ Framsteg inom  genetik . - Academic Press , 1971. - ISBN 9780080568027 . Arkiverad 16 maj 2016 på Wayback Machine
26. ↑ Hays F.A. , Watson J. , Ho P.S. Varning! DNA-korsning: kristallstrukturer av Holliday-korsningar.  (engelska)  // The Journal of biological chemistry. - 2003. - Vol. 278, nr. 50 . - P. 49663-49666. - doi : 10.1074/jbc.R300033200 . — PMID 14563836 .
27. ↑ Pelesko, John A. Självmontering: vetenskapen om saker som sätter sig  själva . — New York: Chapman & Hall/CRC, 2007. — P. 201, 242, 259. — ISBN 978-1-58488-687-7 .

Ordböcker och uppslagsverk	Britannica (online)