Genomiskt bibliotek

Ett genomiskt bibliotek är en samling av DNA från hela genomet av en enda organism. Detta DNA lagras i en population av identiska vektorer , som var och en innehåller en annan DNA-insättning.

Skapa ett genomiskt bibliotek

För att bygga ett genomiskt bibliotek extraheras DNA från celler och smälts sedan med ett restriktionsenzym för att skära DNA:t i fragment av en viss storlek [1] [2] . Fragmenten infogas sedan i en vektor med hjälp av DNA-ligasenzymet . Vidare kan DNA-vektorn infogas i värdorganismen - vanligtvis i populationen av Escherichia coli ( E. coli ) eller jäst , där varje cell innehåller kopior av vektorn med en unik insättning.

Lagring och applikationer

Att använda värdcellen för att lagra vektorn möjliggör enkel amplifiering och identifiering av specifika kloner från biblioteket för analys. Det genomiska biblioteket kan lagras under lång tid (fryst). Vid behov isoleras individuella bakterie- eller jästkloner som innehåller DNA-fragment med de önskade generna eller andra element i genomet och förökas ( klonas ). Delar av genomet som klonas på detta sätt isoleras från celler och används för att lösa olika teoretiska och praktiska problem inom genetik , medicin (inklusive diagnostik av ärftliga sjukdomar ) och bioteknik , samt för att kartlägga genom [3] [4] [5 ] .

Screening (från denengelska screening) av biblioteket, det vill säga sökandet efter ett specifikt DNA-fragment bland hundratals och tusentals andra sekvenser, utförs med metodenDNA-hybridiseringmed hjälp avDNA-sonder [3] . Om forskaren känner till åtminstone en liten sekvens avnukleotiderfrån det önskade stället,syntetiserar komplementärsekvens (primercirka 20 nukleotider lång) och märker den med antingenradioaktiv isotopellerfluorescerandemärkning. Enreplik är gjordpetriskålmedkoloniergenomblottingnitrocellulosaeller annat membran appliceras på skålen, på vilket avtrycket av alla kolonier finns kvar. Därefter utförs förstörelsen av bakterieceller på avtrycket, frisättningen av DNA frånproteinerialkalisktmedium och denatureringen av DNA till en enkelsträngad molekyl. Därefter behandlas alla kolonierna med en sond och de tittar på vilka av kolonierna som sonden har anslutit sig till enligt komplementaritetsprincipen. Denna koloni kommer att innehålla det önskade DNA-fragmentet.

Ibland vet forskaren inte vilken DNA-sekvens han letar efter, utan har aminosyrasekvensen för proteinet som studeras. Eftersom flera tripletter av nukleotider (från en till sex) kan motsvara varje aminosyra , kan de troliga kodande DNA:n vara olika. En blandning av sönder framställs sedan som kan känna igen den förmodade sekvensen.

Moderna högteknologiska metoder för screening av genomiska bibliotek (särskilt de som är gjorda med LHC - vektorer ) är baserade på användningen av robotisk (automatiserad) produktion , i valfritt antal kopior, mikroplattor för lagring av kolonier (kloner), samt nitrocellulosa- och nylonmembran (filter) som används direkt för hybridisering med DNA-sonder. En ytterligare ökning av screeningseffektiviteten uppnås genom användning av så kallade overgos-prober (från engelskan  over lapping oli gos  - "överlappande oligonukleotider ") som DNA-sonder [3] [6] . Det är också möjligt att använda PCR för att screena bibliotek.

En annan typ av genomiskt bibliotek är mikrosatellitbiblioteket , vars kloner innehåller tandemupprepningar . Deras sekvensering gör det möjligt att erhålla polymorfa DNA-markörer (microsatellite loci ) för olika genetiska och genomiska tillämpningar [7] .

Se även

Anteckningar

  1. ↑ Lee M.-K., Ren CW, Yan B., Cox B., Zhang H.-B., Romanov MN, Sizemore FG, Suchyta SP, Peters E., Dodgson JB Konstruktion och karakterisering av tre BAC-bibliotek för analys of the chicken genome  (eng.)  // Animal Genetics  : journal. - Oxford , Storbritannien : International Society for Animal Genetics; Blackwell Publishers Ltd , 2003. Vol. 34, nr. 2 . - S. 151-152. — ISSN 0268-9146 . - doi : 10.1046/j.1365-2052.2003.00965_5.x . — PMID 12648103 . Arkiverad från originalet den 22 februari 2015.  (Tillgänglig: 22 februari 2015)
  2. ↑ Sazanov A. A., Romanov M. N., Smirnov A. F. Bibliotek av utökade genomiska kloner som ett verktyg för molekylär cytogenetisk analys av fågelgenomet  // Genetics  : journal. - M . : Nauka , 2005. - T. 41 , nr 5 . - S. 581-589 . — ISSN 0016-6758 . — PMID 15977807 . Arkiverad från originalet den 17 mars 2015.  (Tillgänglig: 17 mars 2015)
  3. ↑ 1 2 3 Song B.-K., Nadarajah K., Romanov MN Ratnam W. Cross-species bakteriell artificiell kromosom (BAC) biblioteksscreening via overgo-baserad hybridisering och BAC-contig kartläggning av ett skördeökande kvantitativt draglokus (QTL) ) yld1.1 i det malaysiska vildriset Oryza rufipogon  (engelska)  // Cellular & Molecular Biology Letters : journal. — Wrocław , Polen ; Berlin , Heidelberg , Tyskland : Cellular & Molecular Biology Letters, University of Wrocław , Ministeriet för vetenskap och högre utbildning, Polen ; Springer Science+Business Media , 2005. Vol. 10, nr. 3 . - s. 425-437. — ISSN 1425-8153 . — PMID 16217554 . Arkiverad från originalet den 15 mars 2015.  (Tillgänglig: 15 mars 2015)
  4. ↑ Romanov MN, Koriabine M., Nefedov M., de Jong PJ, Ryder OA Konstruktion av ett kaliforniskt kondor-BAC-bibliotek och första generationens jämförande fysiska kyckling- kondorkarta som en genomikresurs för bevarande av hotade arter  //  Genomics  : log . - Amsterdam , Nederländerna : Academic Press Inc. , Elsevier Science BV , 2006. - Vol. 88, nr. 6 . - s. 711-718. — ISSN 0888-7543 . - doi : 10.1016/j.ygeno.2006.06.005 . — PMID 16884891 . Arkiverad från originalet den 18 februari 2015.  (Tillgänglig: 18 februari 2015)
  5. ↑ Romanov MN, Dodgson JB, Gonser RA, Tuttle EM Jämförande BAC-baserad kartläggning i vitstrupsparven, en ny beteendegenomisk modell, med användning av interspecies overgo hybridization  // BMC Research Notes  : journal  . - London , Storbritannien: BioMed Central Ltd , 2011. - Vol. 4. - S. 211. - ISSN 1756-0500 . - doi : 10.1186/1756-0500-4-211 . — PMID 21693052 . Arkiverad från originalet den 2 mars 2015.  (Tillgänglig: 2 mars 2015)
  6. ↑ Romanov MN , Dodgson JB Cross-species övergår hybridisering och jämförande fysisk kartläggning inom fågelgenom  //  Animal Genetics: journal. — Oxford, Storbritannien: International Society for Animal Genetics; Blackwell Publishers Ltd, 2006. - Vol. 37, nr. 4 . - s. 397-399. — ISSN 0268-9146 . - doi : 10.1111/j.1365-2052.2006.01463.x . — PMID 16879356 . Arkiverad från originalet den 15 februari 2015.  (Tillgänglig: 15 februari 2015)
  7. ↑ Romanov MN , Jones KC , Chemnick LG , Stremel-Mork E. , Otten C. , Da Y. , Akhunov ED , Ryder OA (2009-01-10). Kalifornien kondor mikrosatellit-berikat bibliotek som ett verktyg för genetiska och genomiska studier i en hotad art . International Plant and Animal Genome XVII Conference, San Diego, 10-14 januari 2009 . San Diego , CA , USA : Scherago International. sid. 107 Sammanfattning P517 . Hämtad 2009-01-10 . Arkiverad 23 januari 2012 på Wayback Machine 

Litteratur