Syntes av oligonukleotider

Syntesen av oligonukleotider  är den kemiska syntesen av relativt korta fragment av nukleinsyror med en given kemisk struktur (sekvens). Metoden används i modern laboratoriepraxis för att erhålla oligonukleotider med den önskade sekvensen på ett snabbt och billigt sätt.

Den vanligaste metoden för syntes av oligonukleotider är baserad på användningen av amidofosfiter  , byggstenar som är reaktiva derivat av deoxiribonukleosider ( dA , dC , dG , T ) eller ribonukleosider ( A , C , G , U ) och tillåter syntes av korta fragment av DNA respektive RNA . Andra amidofosfiter används också som gör det möjligt att införa modifierade nukleosider, olika märkningar och funktionella grupper i produktkedjan . Under syntesen tillsätts dessa reagens i tur och ordning, i den ordning som anges av målproduktens sekvens, till kedjan som växer på fastfasbäraren . Denna process var helt automatiserad i slutet av 1970-talet och utförs för närvarande i dedikerade datorstyrda syntar.

Efter fullbordande av syntesen separeras oligonukleotiden från bäraren, skyddsgrupperna som används under syntesen avlägsnas och den resulterande produkten renas genom elektrofores eller HPLC .

Syntetiska oligonukleotider används i stor utsträckning inom molekylärbiologi och medicin, till exempel som antisens -oligonukleotider, primers för DNA-sekvensering och amplifiering , sönder för att bestämma komplementära DNA- och RNA-sekvenser, verktyg för riktat införande av mutationer och restriktionsställen , och för syntes av konstgjorda gener .

Historik

Under utvecklingen av oligonukleotidsyntes har fyra huvudmetoder utvecklats för att skapa bindningar mellan nukleosider . Dessa metoder diskuteras i detalj i detaljerade litteraturöversikter [1] [2] [3] .

Tidigt arbete och den moderna H-fosfonatmetoden

I början av 1950-talet lade Alexander Todds grupp från Cambridge grunden för H-fosfonat- och fosfotriestermetoderna för syntes av oligonukleotider [4] [5] genom att syntetisera skyddat klorofosfat 4 , reagera det med 3'-skyddat tymidin 5 och bekräftar strukturen av den resulterande skyddade dinukleotiden 6 genom enzymatisk klyvning. Märkligt nog utfördes inget ytterligare arbete i denna riktning vid Cambridge (Todd noterade i sin självbiografi att syntesen av oligonukleotider inte lockade honom) [1] .

En återgång till Todds arbete kom inte förrän trettio år senare, när två forskargrupper anpassade H-fosfonatkondensering till fastfassyntes med hjälp av nukleosid H-fosfonater som byggstenar, och pivaloylklorid , 2,4,6-triisopropylbensensulfonylklorid (TIPS- Cl) och andra föreningar - som aktivatorer [6] [7] . I praktiken organiserades metoden som en enkel syntetisk cykel bestående av två steg: avlägsnande av dimetoxitritylskyddet och kondensation.

Oxidationen av H-fosfonatdiesterbindningen mellan nukleosider i denna metod utförs efter syntesen av oligonukleotidkedjan under inverkan av en lösning av jod i vattenhaltig pyridin . Vid behov kan oxidationen utföras i vattenfria miljöer [8] . Metoden gör det också möjligt att syntetisera tiofosfat [9] och selenofosfat [10] analoger av oligonukleotider. Oxidation med koltetraklorid i närvaro av primära och sekundära aminer leder till amidofosfatanaloger [11] [12] .

Som regel skyddas 5'-hydroxylgruppen i alla 3'-H-fosfonater av nukleosider och aminogruppen i H-fosfonater av nukleosider med baserna A, G och C före användning i syntesen av samma grupper som i amidofosfitmetoden . Skyddet av aminogrupper är dock inte strikt nödvändigt [8] [13] .

Fosfodiestermetod

På 1950-talet utvecklade Har Gobind Korana och medarbetare en fosfodiestermetod där 3'- O -acetylnukleosid-5'- O - fosfat aktiverades av N , N' - dicyklohexylkarbodiimid (DCC) eller p -toluensulfonylklorid ( TsCl ) och injicerades sedan i reaktion med en 5'- O - skyddad nukleosid för att bilda dinukleosidmonofosfat [14] . Efter avlägsnandet av den skyddande acetylgruppen i det basiska mediet, utfördes ytterligare kedjeförlängning. Uppsättningar av tri- och tetrameroligonukleotider syntetiserades genom stegvis kondensation. Dessutom utfördes kondensation av oligomera fragment för att erhålla längre oligonukleotider [1] .

Skyddet av fosfatgrupper i fosfodiestersyntesen användes inte, och detta ledde uppenbarligen till sidoreaktioner och minskade utbytet av syntesen. Korana trodde dock att ett skydd av fosfatgrupper skulle leda till förlusten av oligonukleotidernas främsta fördel - deras polyelektrolytnatur , som han trodde effektivt skulle kunna användas för att rena oligonukleotider. En viktig upptäckt av Koranen var användningen av tritylskyddsgrupper för att skydda 5'-hydroxylnukleosider [1] .

Fosfotrietermetod

På 1960-talet utvecklade grupper ledda av R. Letsinger ( eng.  R. Letsinger ) [15] [16] och K. Reese ( eng.  C. Reese ) [17] fosfotriestermetoden. Den avgörande skillnaden från fosfodiestermetoden är det preliminära skyddet av fosfatet i reaktanten och produkten med cyanoetylgruppen -CH2CH2CN . Denna förändring eliminerade möjligheten att förgrena oligonukleotider vid fosfatgrupperna. Metodens större selektivitet gjorde det möjligt att använda mer reaktiva kondenserande reagens och katalysatorer [18] [19] , vilket avsevärt minskade syntesens varaktighet. Fosfotriestermetoden implementerades både i lösning och i fast fas [1] .

Med denna metod var det möjligt att syntetisera två dubbelsträngade oligonukleotider 77 och 104 baspar långa, vars sekvens motsvarade insulinets A- och B-kedjor , vilket sedan gjorde det möjligt att framgångsrikt uttrycka dessa gener [1] .

Fosfittriestermetod

På 1970-talet introducerades fosfittriestermetoden för bildning av internukleosidbindningar i praktiken, där mycket mer reaktiva nukleosidderivat baserade på P(III), ursprungligen klorofosfiter, användes [20] . Senare använde en grupp under ledning av M.  Caruthers mindre aggressiva och mer selektiva 1H-tetrazolidfosfiter och implementerade metoden i en fastfasversion [ 21] . Kort därefter förbättrade anställda från samma grupp metoden genom att använda de mer stabila nukleosidamidofosfiterna som byggstenar . Ersättningen av den mindre praktiska metylfosfatskyddsgruppen [22] [23] [24] med den mer bekväma 2-cyanoetylgruppen [25] gav varianten av nukleosidamidofosfiter, som fortfarande är standardreagenset för syntes av oligonukleotider idag. Flera ytterligare förbättringar av metoderna för att syntetisera monomera block, oligonukleotidsyntetiserare och monterings- och deblockeringsprotokoll har förvandlat amidofosfitmetoden till en mycket pålitlig och produktiv metod för att erhålla syntetiska oligonukleotider [26] .

Syntes med amidofosfitmetoden

Byggstenar

Nukleosidamidofosfiter

1976 fann Letsinger och medarbetare att trevärda fosforföreningar är mycket mer aktiva reagenser än motsvarande femvärda fosforderivat. Rollen för P(III)-föreningar blev uppenbar efter utvecklingen av N,N -diisopropylamidfosfitderivat av nukleosider ( nukleosidamidofosfiter ) [1] [22] av M. Carruthers , som fortfarande spelar rollen som standardbyggstenar i amiden. fosfitsyntesmetoden idag. För att förhindra oönskade bireaktioner måste de funktionella grupperna av amidofosfiter blockeras med skyddsgrupper . Efter att sammansättningen av oligonukleotidkedjan är avslutad, avlägsnas alla skyddsgrupper, vilket resulterar i måloligonukleotiden. Nedan är skyddsgrupperna som används i kommersiellt tillgängliga standard nukleosidamidofosfiter [27] :

  • Hydroxylgruppen i 5'-positionen skyddas av en 4,4'-dimetoxitrityl (DMT) skyddsgrupp, som avlägsnas under sura betingelser.
  • Tymin och uracil , de kvävehaltiga baserna av tymidin respektive uridin , har inte exocykliska aminogrupper så de behöver inte skyddsgrupper. Guanin har en exocyklisk aminogrupp med låg basicitet , så det sidreagerar inte med amidofosfiter under kondensationsreaktionsbetingelser. Emellertid är amidofosfitreagenset baserat på N2-oskyddat 5'- O -DMT-2'-deoxiguanosin dåligt lösligt i acetonitril  , det lösningsmedel som oftast används vid syntes av oligonukleotider. Tvärtom är N2-skyddade derivat av samma förening mycket lösliga i acetonitril och används därför mycket mer allmänt. Kvävebaserna adenin och cytosin innehåller aminogrupper som kan reagera med amidofosfiter under syntes, och därför måste dessa grupper skyddas för syntes under standardbetingelser. Ändå, genom att införa ytterligare steg i syntescykeln, är det möjligt att uppnå användningen av oskyddade amidofosfiter dA och dC [28] . Skyddsgrupper på kvävehaltiga baser måste bibehållas under hela syntesen, så grupper används vars reaktivitet är motsatt den för 4,4'-dimetoxitritylgruppen, som avlägsnas efter varje cykel. De två mest använda metoderna beskrivs nedan.
    • I den första standardmetoden används bensoylskydd (Bz) för att skydda adenin och cytosin , medan guanin skyddas av en isobutyrylgrupp ( i Bu) [29] . Senare föreslogs en acetyl (Ac)-grupp för att skydda cytosin , som kan avlägsnas med ammoniak , eller en blandning av ammoniak och metylamin [30] .
    • I det andra, mildare, skyddsschemat skyddas adenin av isobutyryl [31] eller fenoxiacetyl (PAC) [32] grupper. Cytosin innehåller en acetylskyddsgrupp [30] medan guanin skyddas av 4-isopropylfenoxiacetyl ( i Pr-PAC) [33] eller dimetylformamidin (dmf) [34] grupper. Mjuka skyddsgrupper avlägsnas lättare än standardgrupper, men amidofosfiter med dessa grupper är mindre stabila när de förvaras i lösning.
  • Fosfitgruppen skyddas av en 2-cyanoetylgrupp [25] . Närvaron av fosfitskydd är obligatoriskt för amidofosfit och den nybildade fosfittriestergruppen innan den senare oxideras till fosfotriestern. Samtidigt är närvaron av skydd på fosfatgrupperna i ett redan sammansatt oligonukleotidfragment inte nödvändigt för framgångsrika ytterligare kondensationscykler [35] .
  • RNA- syntes använder byggstenar med en "extra" 2'-hydroxylgrupp som inte är involverad i syntesen. Den är skyddad med en tert -butyldimetylsilyl (TBDMS) [36] [37] [38] eller triisopropylsilyloximetyl (TOM) [39] [40] grupp. Båda grupperna avlägsnas genom inverkan av fluoridjoner .
  • Fosfitgruppen innehåller också en diisopropylamingrupp ( i - Pr2N ) som är reaktiv under sura betingelser. Vid aktivering under inverkan av en sur katalysator ersätts denna grupp av 5'-hydroxylgruppen i den växande kedjan [22] .
Icke-nukleosid amidofosfiter

Icke-nukleosid amidofosfiter är amidofosfitreagens utformade för att introducera en mängd olika funktionella grupper och märkningar vid den terminala positionen av en oligonukleotid eller mellan nukleotidrester i mitten av en sekvens. För att vara lämplig för införande i mitten av kedjan måste amidofosfiten innehålla minst två hydroxylgrupper, av vilka en skyddas av en DMT-grupp och den andra bär en reaktiv amidofosfitdel.

Icke-nukleosid amidofosfiter används för att införa i oligonukleotiden olika grupper som inte finns i naturliga nukleosider. Ett brett spektrum av liknande reagens har syntetiserats och tjänar till exempel för införandet av 5'-fosfat [41] , aminogrupp [42] , merkaptogrupp [ 43] , aldehyd [44] och karboxyl [45] grupper, alkynfragment [46] , fluorescerande färgämnen [47] och quenchers, hydrofila [48] och hydrofoba [49] modifieringar, biotin [50] etc.

Syntetisk cykel

Syntes av oligonukleotider utförs genom stegvis kondensation av byggstenar till 5'-änden av den växande kedjan tills målsekvensen är sammansatt. Förekomsten av sidoreaktioner innebär en begränsning av längden på den syntetiserade oligonukleotiden (upp till 200 nukleotidrester ), eftersom antalet fel ackumuleras med en ökning av längden på målprodukten [26] . Uppsättningen av operationer som krävs för att förlänga kedjan med en nukleotidrest kallas syntescykeln och består av fyra kemiska reaktioner.

Steg 1: Borttagning av tritylskydd

DMT-skyddsgruppen avlägsnas med en syralösning, såsom 2% triklorättiksyra eller 3% diklorättiksyra i ett inert lösningsmedel ( metylenklorid eller toluen ). Den resulterande orangefärgade dimetoxitritylkatjonen tvättas ut ur systemet. Som ett resultat bildas en oligonukleotidprekursor med en fri 5'-hydroxylgrupp fixerad på en fastfasbärare. Att genomföra processen under en längre tid eller använda mer koncentrerade syralösningar leder till en bireaktion av depurinering  - eliminering av purinbaser från ribosresten .

Steg 2: Kondensering

En lösning av nukleosidamidofosfit (0,02–0,2 M) eller en blandning av flera amidofosfiter i acetonitril aktiveras med en 0,2–0,7 M lösning av en syrakatalysator baserad på en azol : 1 H - tetrazol , 2 -etyltiotetrazol [2-etyltiotetrazol, 51] . -bensyltiotetrazol [52] , 4,5-dicyanimidazol [53] , etc. Blandningen av komponenter sker i syntetiseringsanordningens kommunikationsledningar under leverans av reagens till reaktorn som innehåller en fastfasbärare. Aktiverad amidofosfit i ett 1,5-20-faldigt överskott införs i interaktion med 5'-hydroxylgruppen, vilket bildar en fosfittriesterbindning. Kondensationen av amidofosfiter av 2'-deoxinukleosider fortskrider mycket snabbt och tar som regel cirka 20 sekunder i liten skala. De steriskt hindrade amidofosfiterna av ribonukleosider reagerar mycket långsammare (5-15 min) [54] [55] [56] [57] . Reaktionen är ganska känslig för närvaron av vatten, särskilt när man använder utspädda lösningar av amidofosfiter, så den utförs i ett vattenfritt lösningsmedel, vanligtvis acetonitril . Med en ökning av syntesens skala används mindre överskott och mer koncentrerade lösningar av amidofosfiter. Efter fullbordad reaktion avlägsnas överskott av reaktanter och biprodukter från reaktorn genom tvättning.

Steg 3: Begränsning

Lockning utförs genom att behandla en fastfasbärare med en blandning av ättiksyraanhydrid och 1-metylimidazol (mindre ofta DMAP ) som katalysator . Inom amidofosfitsyntesen tjänar detta steg två syften:

  • Efter slutförandet av kondensationssteget förblir en liten del av 5'-hydroxylgrupperna (0,1-1%) oreagerade och måste avlägsnas från processen för ytterligare kedjeförlängning för att förhindra bildning av oligonukleotider med saknade nukleotidrester inom kedjan. För detta ändamål skyddas de återstående hydroxylgrupperna med acetylgrupper som är resistenta mot syralösningarna som används för att ta bort DMT-skyddet.
  • Det har också rapporterats att amidofosfiter aktiverade med 1H -tetrazol reagerar i lågt utbyte med karbonylsyre vid O 6 - positionen av guanosin [58] . När den oxideras med en blandning av jod och vatten, genomgår denna biprodukt klyvning av purinbasen . De resulterande apurinställena hydrolyseras lätt under den slutliga avskyddningen av oligonukleotiden, vilket leder till bildandet av två kortare oligonukleotider och en minskning av utbytet av målprodukten. O6 -modifikationerna avlägsnas snabbt genom inverkan av ett täckmedel om täckningen utförs före oxidationssteget.
Steg 4: Oxidation

Den internukleosid tre-koordinerade fosfitgruppen som erhålls som ett resultat av kondensation är inte naturlig och har begränsad stabilitet under syntesbetingelser. Behandling av underlaget med jod och vatten i närvaro av en svag bas ( pyridin , 2,6-lutidin eller kollidin ) oxiderar fosfiten till en fosfotriester, en prekursor till den naturliga fosfodiester-internukleosidbindningen. Oxidation kan också utföras under vattenfria förhållanden med användning av tert-butylhydroperoxid [59] eller ett mer lämpligt reagens, ( 1S )-(+)-(10-kamfersulfonyl)oxaziridin [60] .

Solid state-bärare

Under hela fastfassyntesen är oligonukleotiden kovalent bunden till fastfasbäraren via 3'-hydroxylgruppen. Stödet placeras vanligtvis i kolumner, vars storlek beror på syntesens skala. Under de senaste 10 åren har högpresterande oligonukleotidsyntetisatorer blivit utbredda, där bäraren placeras i plattans brunnar (96 eller 384 brunnar per platta) [61] . Efter slutet av syntesen klyvs oligonukleotiden från bäraren och går i lösning.

Mediematerial
CPG-porstorlek, Å [62] Belastning,
µmol/g		 Produktlängd,
baser
500 80-90 <50
1000 50-60 80
1500 35-45 100
2000 20-30 150
3000 200

Till skillnad från organisk fastfassyntes och peptidsyntes, fortskrider oligonukleotidsyntes bättre på icke-svällande eller svagt svällande fastfasbärare. De vanligaste bärarna är kontrollerat porglas (CPG) och makroporös polystyren (MPPS) [ 63] . 

  • Det huvudsakliga kännetecknet för CPG är pordiametern , som kan vara från 70 till 4000 Å , medan porerna är mycket enhetliga i storlek (avvikelsen är ±10% för 80% av porerna). För att göra en sådan bärare lämplig för syntes, behandlas den med (3-aminopropyl)trietoxisilan (APTES) för att ge aminopropyl CPG. Långkedjig aminoalkyl CPG , LCAA CPG används  också ofta [63] . Två nyckelegenskaper hos syntesen beror på porstorleken: skalan, bestämd av antalet aktiva funktionella grupper per massenhet av bäraren, och den maximala längden av den syntetiserade oligonukleotiden. Data om de vanligaste CPG-bärarna ges i tabellen [62] .
  • Även vid syntesen av oligonukleotider används makroporös polystyren, erhållen genom sampolymerisation av styren och divinylbensen , med den införda aminometylmodifieringen. Denna polystyren gör det möjligt att syntetisera oligonukleotider med en längd på mindre än 40–50 baser. För små synteser kan en polystyrenbärare användas med en belastning på 10 till 45 µmol/g. För synteser på en skala av 25–100 µmol används polystyren med en belastning på 200 till 400 µmol/g. Slutligen är polystyren mer lämplig än CPG för storskaliga synteser (större än 100 µmol) [62] .
Linker kemi

För ändamålen med oligonukleotidsyntes är nukleosidsuccinater eller icke-nukleosidlänkar kovalent bundna till aminogrupperna i aminopropyl-CPG, LCAA CPG eller aminometyl MPPS. Vanligtvis används tre olika typer av media.

  • Nukleosidbärare . I det historiskt första tillvägagångssättet utförs syntesen av en oligonukleotid på en bärare, till vilken en 3'-terminal startnukleosid är kovalent fäst i förväg genom ett bärnstenssyrafragment . Följaktligen börjar syntesen med tillsats av en amidofosfit som inte motsvarar den första, utan den andra nukleotiden, räknat från 3'-änden. Nackdelen med en sådan bärare är att innan syntesen påbörjas är det nödvändigt att välja den nukleosidbärarvariant som motsvarar den 3'-terminala nukleosiden i den syntetiserade oligonukleotiden, vilket minskar syntesprocessens produktivitet och ökar sannolikheten för mänskliga fel [64] . Alternativa fastfasbärare med en spacer baserad på diglykolsyra och oxalsyra har också föreslagits för snabbare separation av produkten från bäraren [63] .
  • Universell media . I denna metod börjar syntesen med en universell bärare, till vilken en icke-nukleosidlinker är fäst [65] . Amidofosfit, motsvarande den 3'-terminala nukleosiden, fästs till den universella bäraren enligt standardmetoder under den första syntescykeln. Därefter fortsätter sammansättningen av den önskade sekvensen och sedan klyvs oligonukleotiden från bärarens yta. Fördelen med detta tillvägagångssätt är att i alla synteser, oavsett vilken sekvens som behöver syntetiseras, kan en enda universell bärare användas [64] .
  • Särskilda bärare används för att fästa någon funktionell grupp eller reportergrupp till 3'-positionen av syntetiska oligonukleotider. Bärare finns kommersiellt tillgängliga för introduktion av aminogrupper [66] , merkaptogrupper [ 67] , fluorescenssläckare [68] etc.

Tiofosfatoligonukleotider och deras syntes

Tiofosfatoligonukleotider är modifierade oligonukleotider där en av syreatomerna i fosfatresten är ersatt av en svavelatom . Endast de tiofosfater används i stor utsträckning där svavel inte är en länk mellan nukleosidresten och fosforatomen. I detta fall leder ersättningen av syre med svavel till bildandet av ett nytt kiralitetscentrum på P(V)-atomen, därför bildas i det enklaste fallet av en dinukleotid SP- och RP - diastereomerer . I en n -mer oligonukleotid där alla ( n -1) internukleotidbindningar är tiofosfat, är antalet diastereomerer 2 ( n - 1) . Som icke-naturliga analoger av nukleinsyror är oligonukleotidtiofosfater betydligt mer resistenta mot hydrolys av nukleaser , en klass av enzymer som klyver nukleinsyror genom hydrolys av PO-bindningen i fosfodiesterbryggan. Denna egenskap bestämmer användningen av tiofosfater som antisensoligonukleotider i in vivo- och in vitro- applikationer där exponering för nukleaser är oundviklig. På liknande sätt, för att öka stabiliteten hos små störande RNA , introduceras ofta åtminstone en tiofosfatbindning vid 3'-positionen av sense- och antisenssträngarna. I optiskt rena oligonukleotidtiofosfater är diastereomerer där alla fosforcentra har SP -konfigurationen mer resistenta mot enzymatisk hydrolys än deras RP - motsvarigheter. Syntesen av optiskt rena tiofosfater är dock svår [69] [70] .

Syntesen av oligonukleotidtiofosfater liknar syntesen av naturliga oligonukleotider. Skillnaden är att oxidationssteget ersätts av en sulfuriseringsreaktion. Följande kommersiellt tillgängliga reagens används för införande av svavel:

  • 3-(Dimetylaminometylidenamino)-3H-1,2,4-ditiazol-3-tion ( DDTT ) ger en hög sulfuriseringshastighet och är stabil i lösning [71] .
  • Beaucage  Reagent har en högre löslighet i acetonitril och låter reaktionen fortgå på kortare tid . Den har dock begränsad stabilitet i lösning och är mindre effektiv på att sulfurisera RNA-bindningar [72] .
  • N,N,N',N'-Tetraetyltiuramdisulfid ( TETD ) är löslig i acetonitril, men reaktionen av sulfurisering av DNA-internukleosidbindningen tar 15 minuter, vilket är 10 gånger långsammare än i fallet med de två tidigare föreningarna [ 73] .

Andra sulfuriserande reagenser har också utvecklats [74] .

Vid syntesen av tiofosfat-oligonukleotider utförs kapslingssteget efter sulfuriseringen. Om kapslingar utförs före sulfurisering, kan fastfasbäraren efter kapsling innehålla restmängder av ättiksyraanhydrid och 1-metylimidazol. Den täckande blandningen hindrar svavelöverföringsreaktionen, vilket leder till bildandet av tiofosfat-oligonukleotider med ett ökat innehåll av fosfatenheter. I det här fallet rekommenderas det att utföra kapsling efter sulfuriseringsreaktionen [71] .

Automation

Tidigare utfördes oligonukleotidsyntes manuellt i lösning eller på den fasta fasen. För fastfassyntes har olika anordningar baserade på sprutor med porösa membran eller miniatyrglasfilter anpassats, som gör det möjligt att tvätta fastfasbäraren med lösningar av reagens och avlägsna dem med hjälp av vakuum [76] .

För närvarande utförs fastfassyntes automatiskt i datorstyrda oligonukleotidsyntes. Dessa anordningar består av en serie ventiler kopplade till reagensbehållare, samt solenoider som öppnar eller stänger en eller annan ventil. I sin tur styrs solenoiderna av en dator som kör syntesprogrammet. När ventilen är öppen pumpas ett visst reagens genom kolonnen som innehåller fastfasbäraren under den tid som anges av programmet. Tiden och sekvensen för reagenstillförseln är konstant för varje synteskörning; den enda variabeln är den monomera reaktanten som måste kondenseras i en given cykel. Dess urval görs också av programmet i enlighet med den specificerade oligonukleotidsekvensen [77] .

Syntesen kan implementeras i kolumn-, plåt- eller chipformat. Kolonnsyntesmetoden är lämplig för forskning, eller storskalig syntes av dessa polymerer, där hög genomströmning av deras syntes inte krävs. Plattformatet är speciellt utformat för hög genomströmning, småskalig syntes för att möta den växande efterfrågan inom industrin och vetenskapen på syntetiska oligonukleotider. Olika typer av synthesizers finns kommersiellt tillgängliga [78] [79] [80] .

Postsyntetisk bearbetning

För att erhålla måloligonukleotiden är det nödvändigt att ta bort alla skyddsgrupper i oligonukleotiden:

  • en 5' DMT-grupp;
  • acylskyddande grupper på kvävehaltiga baser;
  • 2-cyanoetylgrupper som skyddar internukleosidfosfatgrupper.

5'-DMT-gruppen avlägsnas vanligtvis med en sur lösning under automatisk syntes. Klyvning av oligonukleotiden från bäraren, avskyddande av baser och cyanoetylskyddande grupper sker vanligtvis samtidigt under inverkan av oorganiska baser eller aminer . Vanligtvis används vattenhaltig ammoniak , en lösning av metylamin , deras blandningar [30] , gasformig ammoniak eller metylamin [81] för dessa ändamål , mindre ofta lösningar av andra primära aminer och alkalier vid rumstemperatur eller förhöjd temperatur. Denna behandling tar bort alla skyddsgrupper från 2'-deoxioligonukleotiderna, vilket lämnar en lösning av slutprodukten. I fallet med 2'- O -silylskyddade oligoribonukleotider läggs ett steg till för att avlägsna silylskyddsgrupperna under inverkan av fluoridjon [82] .

Tillämpningen av denna metod begränsas av det faktum att denna bearbetning producerar akrylnitril som en biprodukt . Under avskyddande förhållanden kan akrylonitril alkylera kvävehaltiga baser, huvudsakligen N3-positionen av tymin och uracil , för att bilda 2-cyanoetylderivat genom Michael-reaktionen . Bildandet av dessa biprodukter kan undvikas genom att behandla oligonukleotiderna bundna till bäraren i fast fas med lösningar av baser i ett organiskt lösningsmedel, såsom 50 % trietylamin i acetonitril [83] eller 10 % dietylamin i acetonitril [84] .

En oskyddad oligonukleotid kan användas utan ytterligare rening eller ytterligare renas med någon av följande metoder [85] .

  • Den råaste metoden för att rena en oligonukleotid är avsaltning, d.v.s. separering av lågmolekylära föroreningar som bildas under avlägsnandet av skyddsgrupper ( bensamid , isobutyramid , ammoniumacetat, etc.). För stora mängder oligonukleotider utförs avsaltning lämpligen genom utfällning i etanol : i detta fall fälls produkten ut, medan föroreningar och i vissa fall kortare oligonukleotider förblir i lösning. För små mängder används gelfiltrering [86] .
  • Rening av trunkerade oligonukleotider kan effektivt utföras med användning av polyakrylamidgelelektrofores , som är baserad på separation av oligonukleotider efter storlek på grund av deras olika rörlighet i gelén under påverkan av ett elektriskt fält. Efter ultraviolett absorptionselektrofores bestäms ett gelfragment innehållande måloligonukleotiden, denna del skärs ut och den renade oligonukleotiden isoleras genom blötläggning eller elektroeluering [87] .
  • Den mest kompletta reningen uppnås med högpresterande vätskekromatografi (HPLC). I denna metod är separationen baserad på hydrofob (omvänd fas HPLC) eller laddning (jonbytes-HPLC) interaktion av oligonukleotider med en sorbent. Styrkan i denna interaktion påverkar ordningen och tiden för eluering av produkten från den kromatografiska kolonnen, vilket gör det möjligt att effektivt separera produkter av olika längder. Ett alternativt tillvägagångssätt används ofta där 5'-DMT-gruppen i oligonukleotiden inte avlägsnas före rening. I detta fall, på grund av närvaron av en hydrofob skyddsgrupp, ökar dess hydrofobicitet och styrkan av interaktion med den hydrofoba sorbenten signifikant, och den kromatografiska rörligheten minskar, vilket gör produktisoleringen mer effektiv. DMT-gruppen avlägsnas sedan i ett surt medium, och lösningen indunstas och avsaltas [88] .

Karakterisering

Som med andra organiska ämnen är det användbart att karakterisera oligonukleotiden efter att den har framställts. I mer komplexa fall (forskning eller storskalig syntes) görs detta två gånger: efter avskyddning och efter rening. Även om det mest korrekta tillvägagångssättet för att karakterisera en oligonukleotid är sekvensering , en relativt billig och rutinmässig procedur, förhindrar ekonomiska överväganden dess införande i oligonukleotidproduktion. I daglig praktik är det tillräckligt att erhålla molekylvikten för en oligonukleotid genom att registrera dess masspektrum . Två metoder för masspektrometri används: elektrospray och MALDI -masspektrometri. För att få ett informativt spektrum är det viktigt att ersätta alla metalljoner som kan finnas i provet med ammonium- eller trialkylammoniumjoner.

  • När den joniseras med en elektrospray producerar en oligonukleotid en uppsättning joner som motsvarar olika grader av jonisering av föreningen. En oligonukleotid med en molekylvikt M ger joner med massor ( M  - n H) / n , där M  är molekylvikten för oligonukleotiden i syraform (alla negativa laddningar av fosfodiesterbindningar kompenseras av närvaron av protoner), n  är graden av jonisering, H är väteatomens atommassa (1 Ja). Joner med n från 2 till 5 är mest användbara för karakterisering . Programvara som levereras med moderna instrument kan automatiskt söka efter jontoppar som tillhör en viss oligonukleotid och beräkna molekylvikten för den senare.
  • För att få mer detaljerad information om föroreningar i en oligonukleotid används analytiska metoder som kombinerar HPLC och masspektrometri [89] eller kapillärelektrofores och masspektrometri [90] .

Se även

Anteckningar

  1. ↑ 1 2 3 4 5 6 7 Reese CB Oligo- och polynukleotider: 50 år av kemisk syntes   // Org . Biomol. Chem. - 2005. - Vol. 3 , nr. 21 . - P. 3851-3868 . doi : 10.1039 / b510458k . — PMID 16312051 .
  2. ↑ Brown DM En kort historia av oligonukleotidsyntes // Protokoll för oligonukleotider och analoger: syntes och egenskaper. - Springer, 1993. - S. 1-17. — (Methods in Molecular Biology). - doi : 10.1385/0-89603-281-7:1 .
  3. ↑ Iyer RP, Beaucage SL 7.05 Oligonukleotidsyntes // Omfattande naturproduktkemi. - Elsevier, 1999. - S. 105-152.
  4. ↑ Michelson AM, Todd AR Nucleotides del XXXII. Syntes av en ditymidin-dinukleotid innehållande en 3': 5'-internukleotidkoppling  (engelska)  // J. Chem. soc. - 1955. - P. 2632-2638 . - doi : 10.1039/JR9550002632 .
  5. ↑ Hall RH, Todd A., Webb RF 644. Nukleotider. Del XLI. Blandade anhydrider som mellanprodukter vid syntesen av dinukleosidfosfater  //  J. Chem. soc. - 1957. - P. 3291-3296 . - doi : 10.1039/JR9570003291 .
  6. ↑ Froehler BC, Ng PG, Matteucci MD Syntes av DNA via deoxinukleosid H-fosfonatintermediärer   // Nucl . Acids Res. - 1986. - Vol. 14 , nr. 13 . - P. 5399-5407 . doi : 10.1093 / nar/14.13.5399 . Arkiverad från originalet den 6 maj 2022.
  7. ↑ Garegg PJ, Lindh I., Regberg T., Stawinski J., Strömberg R. Nucleoside H-phosphonates. III. Kemisk syntes av oligodeoxiribonukleotider genom vätefosfonatmetoden  (engelska)  // Tetrahedron Lett. - 1986. - Vol. 27 , nr. 34 . - P. 4051-4054 . - doi : 10.1016/S0040-4039(00)84908-4 .
  8. ↑ 1 2 Wada T., Sato Y., Honda F., Kawahara S., Sekine M. Kemisk syntes av oligodeoxiribonukleotider med användning av N-oskyddade H-fosfonatmonomerer och karbon- och fosfoniumkondenserande reagenser: O-selektiv fosfonylering och kondensering J. .Amer. Chem. soc. - 1997. - T. 119 , nr 52 . - S. 12710-12721 . - doi : 10.1021/JA9726015 .
  9. ↑ Agrawal S., Tang JY Effektiv syntes av oligoribonukleotid och dess fosforotioatanalog med hjälp av H-fosfonatmetoden // Tetrahedron Lett. - 1990. - T. 31 , nr 52 . - S. 7541-7544 . - doi : 10.1016/S0040-4039(00)97293-9 .
  10. ↑ Tram K., Wang X., Yan H. Facile Synthesis of Oligonucleotide Phosphoroselenoates // Org. Lett. - 2007. - T. 9 , nr 24 . - S. 5103-5106 . - doi : 10.1021/ol702305v .
  11. ↑ Froehler BC Deoxinukleosid H-fosfonatdiestermellanprodukter i syntesen av internukleotidfosfatanaloger // Tetrahedron Lett. - 1986. - T. 27 , nr 46 . - S. 5575-5578 . - doi : 10.1016/S0040-4039(00)85269-7 .
  12. ↑ Froehler BC, Ng PG, Matteucci MD Fosforamidatanaloger av DNA: syntes och termisk stabilitet av heteroduplexer // Nucl. Acids Res. - 1988. - T. 16 , nr 11 . - S. 4831-4839 . doi : 10.1093 / nar/16.11.4831 .
  13. ↑ Kung PP, Jones RA H-fosfonat-DNA-syntes utan aminoskydd // Tetrahedron Lett. - 1992. - T. 33 , nr 40 . - S. 5869-5872 . - doi : 10.1016/S0040-4039(00)61075-4 .
  14. ↑ Gilham PT, Khorana HG Studier på polynukleotider. I. En ny och allmän metod för kemisk syntes av C5″-C3″ internukleotidkoppling. Synteser av deoxiribo-dinukleotider  (engelska)  // J. Am. Chem. soc. - 1958. - Vol. 80 , nej. 23 . - P. 6212-6222 . - doi : 10.1021/ja01556a016 .
  15. ↑ Letsinger RL, Mahadevan V. Stegvis syntes av oligodeoxiribonukleotider på en olöslig polymerbärare  //  J. Am. Chem. soc. - 1966. - Vol. 88 , nr. 22 . - P. 5319-5324 . - doi : 10.1021/ja00974a053 . — PMID 10.1021/ja00974a053.
  16. ↑ Letsinger RL, Ogilvie KK Nukleotidkemi. XIII. Syntes av oligotymidylater via fosfotriestermellanprodukter  (engelska)  // J. Am. Chem. soc. - 1969. - Vol. 91 , nr. 12 . - P. 3350-3355 . - doi : 10.1021/ja01040a042 .
  17. ↑ Reese CB Den kemiska syntesen av oligo- och polynukleotider genom fosfotriestermetoden   // Tetrahedron . - 1978. - Vol. 34 , nr. 21 . - P. 3143-3179 . - doi : 10.1016/0040-4020(78)87013-6 .
  18. ↑ Efimov VA, Buryakova AA, Reverdatto SV, Chakhmakhcheva OG, Ovchinnikov Yu. A. Snabb syntes av långkedjiga deoxiribooligonukleotider genom N-metylimidazolidfosfotriestermetoden   // Nucl . Acids Res. - 1983. - Vol. 11 , nr. 23 . - P. 8369-8387 . doi : 10.1093 / nar/11.23.8369 . Arkiverad från originalet den 6 maj 2022.
  19. ↑ Efimov VA, Molchanova NS, Chakhmakhcheva OG Tillvägagångssätt för syntesen av naturliga och modifierade oligonukleotider genom fosfotriestermetoden med O-nukleofil intramolekylär katalys  //  Nukleosider, nukleotider och nukleinsyror. - 2007. - Vol. 26 , nr. 8-9 . - P. 1087-1093 . - doi : 10.1080/15257770701516268 . — PMID 18058542 .
  20. ↑ Letsinger RL, Finnan JL, Heavner GA, Lunsford WB Nucleotide chemistry. XX. Fosfitkopplingsprocedur för generering av internukleotidlänkar  //  J. Am. Chem. soc. - 1975. - Vol. 97 , nr. 11 . - P. 3278-3279 . - doi : 10.1021/ja00844a090 . — PMID 1133350 .
  21. ↑ Matteucci MD, Caruthers MH Syntes av deoxioligonukleotider på en polymerbärare  //  J. Am. Chem. soc. - 1981. - Vol. 103 , nr. 11 . - P. 3185-3191 . - doi : 10.1021/ja00401a041 .
  22. ↑ 1 2 3 Beaucage SL, Caruthers MH Deoxinukleosidfosforamiditer—En ny klass av nyckelmellanprodukter för deoxipolynukleotidsyntes  //  Tetrahedron Lett. - 1981. - Vol. 22 , nr. 20 . - P. 1859-1862 . - doi : 10.1016/S0040-4039(01)90461-7 .
  23. ↑ McBride LJ, Caruthers MH Nukleotidkemi. X. En undersökning av flera deoxinukleosidfosforamiditer användbara för att syntetisera deoxioligonukleotider // Tetrahedron Lett. - 1983. - T. 24 , nr 3 . - S. 245-248 . - doi : 10.1016/S0040-4039(00)81376-3 .
  24. ↑ Adams SP, Kavka KS, Wykes EJ, Holder SB, Galluppi GR Hindered dialkylamino nucleoside phosphite reagens in the syntesen of two DNA 51-mers // J. Amer. Chem. soc. - 1983. - T. 105 , nr 3 . - S. 661-663 . - doi : 10.1021/ja00341a078 .
  25. ↑ 1 2 Sinha ND, Biernat J., McManus J., Köster H. Polymerstödoligonukleotidsyntes XVIII1.2): användning av β-cyanoetyi-N,N-dialkylamino-/N-morfolinofosforamidit av deoxinukleosider för syntes av DNA fragment som förenklar avskyddning och isolering av slutprodukten   // Nucl . Acids Res. - 1984. - Vol. 12 , nr. 11 . - P. 4539-4557 . doi : 10.1093 / nar/12.11.4539 .
  26. ↑ 1 2 Beaucage SL, Iyer RP Framsteg i syntesen av oligonukleotider genom Phosphoramidite Approach   // Tetrahedron . - 1992. - Vol. 48 , nr. 12 . - P. 2223-2311 . - doi : 10.1016/S0040-4020(01)88752-4 .
  27. ^ Glen Research. Applied Biosystems DNA & RNA Synthesizer  Reagens . Hämtad 2 december 2012. Arkiverad från originalet 16 januari 2013.
  28. ↑ Gryaznov SM, Letsinger RL Syntes av oligonukleotider via monomerer med oskyddade baser  //  J. Am. Chem. soc. - 1991. - Vol. 113 , nr. 15 . - P. 5876-5877 . doi : 10.1021 / ja00015a059 .
  29. ↑ Virta P. Fastfassyntes av baskänsliga oligonukleotider   // ARKIVOC . - 2009. - S. 54-83 . - ISSN 1551-7012 . Arkiverad från originalet den 11 oktober 2015.
  30. ↑ 1 2 3 Reddy MP, Hanna NB, Farooqui F. Ultrasnabb klyvning och avskyddning av oligonukleotider Syntes och användning av C Ac- derivat  //  Nukleosider och nukleotider. - 1997. - Vol. 16 , nr. 7-9 . - P. 1589-1598 . - doi : 10.1080/07328319708006236 .
  31. ↑ McMinn DL, Greenberg MM Syntes av oligonukleotider som innehåller 3'-alkylaminer med användning av N-isobutyrylskyddad deoxyadenosinfosforamidit  //  Tetrahedron Lett. - 1997. - Vol. 38 , nr. 18 . - s. 3123-3126 . - doi : 10.1016/S0040-4039(97)00568-6 .
  32. ↑ Schulhof JC, Molko D., Teoule R. Det sista avskyddningssteget i oligonukleotidsyntes reduceras till en mild och snabb ammoniakbehandling genom att använda labila basskyddande grupper   // Nucl . Acids Res. - 1987. - Vol. 15 , nr. 2 . - s. 397-416 . doi : 10.1093 / nar/15.2.397 . — PMID 3822812 . Arkiverad från originalet den 14 mars 2022.
  33. ↑ Zhu Q., Delaney MO, Greenberg MM Observation och eliminering av N-acetylering av oligonukleotider framställda med snabbavlägsnande fosforamiditer och   ultramild avskyddning // Bioorg . Med. Chem. Lett. - 2001. - Vol. 11 , nr. 9 . - P. 1105-1107 . - doi : 10.1016/S0960-894X(01)00161-5 . — PMID 11354354 .
  34. ↑ McBride LJ, Kierzek R., Beaucage SL, Caruthers MH Nucleotide chemistry. 16. Amidinskyddsgrupper för oligonukleotidsyntes  (engelska)  // J. Am. Chem. soc. - 1986. - Vol. 108 , nr. 8 . - P. 2040-2048 . doi : 10.1021 / ja00268a052 .
  35. ↑ Guzaev AP, Manoharan M. Phosphoramidite koppling till oligonukleotider som bär oskyddade internukleosidfosfatdelar  //  J. Org. Chem. - 2001. - Vol. 66 , nr. 5 . - P. 1798-1804 . - doi : 10.1021/jo001591e . — PMID 11262130 .
  36. ↑ Ogilvie KK, Theriault N., Sadana KL Synthesis of oligoribonucleotiders  //  J. Am. Chem. soc. - 1977. - Vol. 99 , nr. 23 . - P. 7741-7743 . - doi : 10.1021/ja00465a073 .
  37. ↑ Usman N., Pon RT, Ogilvie KK Framställning av ribonukleosid 3'-O-fosforamiditer och deras tillämpning på den automatiserade fastfassyntesen av oligonukleotider  //  Tetrahedron Lett. - 1985. - Vol. 26 , nr. 38 . - P. 4567-4570 . - doi : 10.1016/S0040-4039(00)98753-7 .
  38. ↑ Scaringe SA, Francklyn C., Usman N. Kemisk syntes av biologiskt aktiva oligoribonukleotider med användning av β-cyanoetylskyddade ribonukleosidfosforamiditer   // Nucl . Acids Res. - 1990. - Vol. 18 , nr. 18 . - P. 5433-5441 . doi : 10.1093 / nar/18.18.5433 .
  39. ↑ Pitsch S., Weiss PA, Wu X., Ackermann D., Honegger T. Fast and Reliable Automated Synthesis of RNA and Partially 2'-O- Protected Precursors ('Caged RNA') Based on Two Novel, Orthogonal 2'- O-skyddsgrupper, preliminär kommunikation   // Helv . Chem. acta. - 1999. - Vol. 82 , nr. 10 . - P. 1753-1761 . - doi : 10.1002/(SICI)1522-2675(19991006)82:10<1753::AID-HLCA1753>3.0.CO;2-Y .
  40. ↑ Pitsch S., Weiss PA, Jenny L., Stutz A., Wu X. Reliable Chemical Synthesis of Oligoribonucleotiders (RNA) with 2'-O-[(Triisopropylsilyl)oxi]methyl(2'-O-tom)-Protected Phosphoramidites  (engelska)  // Helv. Chem. acta. - 2001. - Vol. 84 , nr. 12 . - P. 3773-3795 . - doi : 10.1002/1522-2675(20011219)84:12<3773::AID-HLCA3773>3.0.CO;2-E .
  41. ↑ Guzaev A., Salo H., Azhayev A., Lönnberg H. En ny metod för kemisk fosforylering av oligonukleotider vid 5'-terminalen   // Tetrahedron . - 1995. - Vol. 51 , nr. 34 . - P. 9375-9384 . - doi : 10.1016/0040-4020(95)00544-I .
  42. ↑ Sinha ND, Cook RM Framställning och tillämpning av funktionaliserade syntetiska oligonukleotider: III. Användning av H-fosfonatderivat av skyddad aminohexanol och merkaptopropanol eller -hexanol  //  Nukl. Acids Res. - 1988. - Vol. 16 , nr. 6 . - P. 2659-2670 . doi : 10.1093 / nar/16.6.2659 . Arkiverad från originalet den 6 maj 2022.
  43. ↑ Ede NJ, Tregear GW, Haralambidis J. Rutinmässig framställning av tiololigonukleotider: Tillämpning på syntesen av oligonukleotidpeptidhybrider  //  Biokonjugatet Chem. - 1994. - Vol. 5 , nej. 4 . - s. 373-378 . doi : 10.1021 / bc00028a016 . — PMID 7948105 .
  44. ↑ Podyminogin MA, Lukhtanov EA, Reed MW Fästning av bensaldehydmodifierade oligodeoxinukleotidsonder till semikarbazidbelagt glas   // Nucl . Acids Res. - 2001. - Vol. 29 , nr. 24 . - P. 5090-5098 . doi : 10.1093 / nar/29.24.5090 .
  45. ↑ Lebedev AV, Combs D., Hogrefe RI Preactivated Carboxyl Linker for the Rapid Conjugation of Alkylamines to Oligonucleotiders on Solid Support  //  Bioconjugate Chem. - 2007. - Vol. 18 , nr. 5 . - S. 1530-1536 . doi : 10.1021 / bc0603891 . — PMID 17877414 .
  46. ↑ Alvira M., Eritja R. Syntes av oligonukleotider som bär 5'-5'-kopplingar med användning av kopparkatalyserade cykloladderingsreaktioner   // Chem . biologisk mångfald. - 2007. - Vol. 4 , nr. 12 . - P. 2798-2809 . - doi : 10.1002/cbdv.200790229 . — PMID 18081090 .
  47. ↑ Kvach MV, Tsybulsky DA, Ustinov AV, Stepanova IA, Bondarev SL, Gontarev SV, Korshun VA, Shmanai VV 5(6 ) -Carboxyfluorescein Revisited: New Protecting Group, Separation of Isomers, and their Spectral Properties on   Chemonucle Bioconjugates/Oligonucle . - 2007. - Vol. 18 , nr. 5 . - P. 1691-1696 . - doi : 10.1021/bc7001874 . — PMID 17696491 .
  48. ↑ Jäschke A., Fürste JP, Nordhoff E., Hillenkamp F., Cech D., Erdmann VA Syntes och egenskaper hos oligodeoxiribonukleotid-polyetylenglykolkonjugat   // Nucl . Acids Res. - 1994. - Vol. 22 , nr. 22 . - P. 4810-4817 . doi : 10.1093 / nar/22.22.4810 . — PMID 7984434 .
  49. ↑ Musumeci D., Montesarchio D. Syntes av ett kolesteryl-HEG-fosforamiditderivat och dess tillämpning på lipidkonjugat av anti-HIV 5'TGGGAG3' Hotodas sekvens   // Molecules . - 2012. - Vol. 17 . - P. 12378-12392 . - doi : 10,3390/molekyler171012378 . — PMID 23090019 . Arkiverad från originalet den 2 november 2015.
  50. ↑ Kayushin A., Demekhina A., Korosteleva M., Miroshnikov A., Azhayev A. Syntes av biotininnehållande fosforamiditlinker med polyeterdistansarm  //  Nukleosider, nukleotider och nukleinsyror. - 2011. - Vol. 30 , nej. 7-8 . - S. 490-502 . doi : 10.1080 / 15257770.2011.587702 . — PMID 21888541 .
  51. ↑ Sproat B., Colonna F., Mullah B., Tsou D., Andrus A., Hampel A., Vinayak R. En effektiv metod för isolering och rening av oligoribonukleotider  //  Nukleosider och nukleotider. - 1995. - Vol. 14 , nr. 1-2 . - S. 255-273 . - doi : 10.1080/15257779508014668 .
  52. ↑ Welz R., Müller S. 5-(Benzylmerkapto)-1H-tetrazol som aktivator för 2'-O-TBDMS fosforamidit byggstenar i RNA-syntes  //  Tetrahedron Lett. - 2002. - Vol. 43 , nr. 5 . - s. 795-797 . - doi : 10.1016/S0040-4039(01)02274-2 .
  53. ↑ Vargeese C., Carter J., Yegge J., Krivjansky S., Settle A., Kropp E., Peterson K., Pieken W. Effektiv aktivering av nukleosidfosforamiditer med 4,5-dicyanoimidazol under oligonukleotidsyntes   // Nucl. Acids Res. - 1998. - Vol. 26 , nr. 4 . - P. 1046-1050 . - doi : 10.1093/nar/26.4.1046 . Arkiverad från originalet den 6 maj 2022.
  54. ↑ Usman N., Ogilvie KK, Jiang MY, Cedergren RJ Den automatiserade kemiska syntesen av långa oligoribunkleotider med användning av 2'-O-silylerade ribonukleosid-3'-O-fosforamiditer på ett glasunderlag med kontrollerade porer: syntes av en liknande 43-nukleotidsekvens till 3'-halvmolekylen av ett Escherichia coli formylmetionin-tRNA // J. Amer. Chem. soc. - 1987. - T. 109 , nr 25 . - S. 7845-7854 . doi : 10.1021 / ja00259a037 .
  55. ↑ Ogilvie KK, Usman N., Nicoghosian K., Cedergren RJ Total kemisk syntes av en 77-nukleotider lång RNA-sekvens med metioninacceptansaktivitet  // Proc. Natl. Acad. sci. USA. - 1988. - T. 85 , nr 16 . - S. 5764-5768 . - doi : 10.1073/pnas.85.16.5764 . — PMID 3413059 .
  56. ↑ Wu T., Ogilvie KK, Perreault JP, Cedergren RJ Bekväm procedur för framställning av specifika blandade DNA-RNA-polymerer // J. Amer. Chem. soc. - 1989. - T. 111 , nr 22 . - S. 8531-8533 . - doi : 10.1021/ja00204a043 .
  57. ↑ Pon RT Förbättrad kopplingseffektivitet med användning av 4-dimetylaminopyridin (DMAP) och antingen tetrazol, 5-(o-nitrofenyl)tetrazol eller 5-(p-nitrofenyl)tetrazol i fastfassyntesen av oligoribonukleotider genom fosforamiditmetod-metoden // . - 1987. - T. 28 , nr 32 . - S. 3643-3646 . - doi : 10.1016/S0040-4039(00)96344-5 .
  58. ↑ Pon RT, Usman N., Damha MJ, Ogilvie KK Förebyggande av guaninmodifiering och kedjeklyvning under fastfassyntesen av oligonukleotider med användning av fosforamiditderivat   // Nucl . Acids Res. - 1986. - Vol. 14 , nr. 16 . - P. 6453-6470 . doi : 10.1093 / nar/14.16.6453 . — PMID 3748816 . Arkiverad från originalet den 6 maj 2022.
  59. ↑ Alul RH, Singman CN, Zhang G., Letsinger RL Oxalyl-CPG: ett labilt stöd för syntes av känsliga oligonukleotidderivat  // Nucl. Acids Res. - 1991. - T. 19 , nr 7 . - S. 1527-1532 . - doi : 10.1093/nar/19.7.1527 . — PMID 2027761 . Arkiverad från originalet den 6 maj 2022.
  60. ↑ Ny produkt : 0,5 M CSO för icke-vattenhaltig oxidation i DNA-syntes  . glenres.com. Datum för åtkomst: 28 januari 2013. Arkiverad från originalet 4 februari 2013.
  61. ↑ BioAutomation. DNA/RNA-oligonukleotidsynthesizer: MerMade 384 (ej tillgänglig länk) . Hämtad 3 december 2012. Arkiverad från originalet 30 september 2011. 
  62. ↑ 1 2 3 Guzaev AP, Pon RT vidfästning av nukleosider och andra länkar till fastfasstöd för oligonukleotidsyntes // Aktuella protokoll i nukleinsyrakemi . Wiley, 2013.
  63. ↑ 1 2 3 Pon RT fastfasstöd för oligonukleotidsyntes // Aktuella protokoll i nukleinsyrakemi. – Wiley, 2001.
  64. ↑ 1 2 Vaijayanthi B., Kumar P., Ghosh PK, Gupta KC Nya framsteg inom oligonukleotidsyntes och deras tillämpningar  //  Indian Journal of Biochemistry and Biophysics. - 2003. - Vol. 40 , nej. 6 . - s. 377-391 . — PMID 22900365 . Arkiverad från originalet den 14 augusti 2017.
  65. ↑ Guzaev AP, Manoharan M. A Conformationally Preorganized Universal Solid Support for Efficiency Oligonucleotide Synthesis  //  J. Am. Chem. soc. - 2003. - Vol. 125 , nr. 9 . - P. 2380-2381 . - doi : 10.1021/ja0284613 . — PMID 12603111 .
  66. ↑ Petrie CR, Reed MW, Adams AD, Meyer Jr. RB Ett förbättrat CPG-stöd för syntes av 3'-amin-svansförsedda oligonukleotider  //  Bioconjugate Chem. - 1992. - Vol. 3 , nr. 1 . - S. 85-87 . - doi : 10.1021/bc00013a014 . — PMID 1616954 .
  67. ↑ Link Technologies. 3'-Thiol Modifier C3 SS CPG (inte tillgänglig länk) . Datum för åtkomst: 4 december 2012. Arkiverad från originalet den 29 juni 2013. 
  68. ↑ Lumiprobe. Black Hole 1 (BHQ-1) quencher CPG (ej tillgänglig länk) . Tillträdesdatum: 4 december 2012. Arkiverad från originalet 23 november 2010. 
  69. ↑ Wilk A., Grajkowski A., Phillips LR, Beaucage SL Deoxyribonucleoside Cyclic N-Acylphosphoramidites as a New Class of Monomers for the Stereocontrolled Synthesis of Oligothymidylyl- och Oligodeoxycytidylyl-Phosphorothioates // J. J. Chem. soc. - 2000. - T. 122 , nr 10 . - S. 2149-2156 . doi : 10.1021 / ja991773u .
  70. ↑ Lebedev AV, Wickstrom E. Chiralitetsproblemet i P-substituerade oligonukleotider  //  Perspectives in Drug Discovery and Design. - 1996. - Vol. 4 , nr. 1 . - S. 17-40 . - doi : 10.1007/BF02172106 .
  71. ↑ 1 2 Guzaev AP Reaktivitet av 3H-1,2,4-ditiazol-3-tioner och 3H-1,2-ditiol-3-tioner som sulfuriseringsmedel för oligonukleotidsyntes  (engelska)  // Tetrahedron Lett. - 2011. - Vol. 52 , nr. 3 . - S. 434-437 . - doi : 10.1016/j.tetlet.2010.11.086 .
  72. ↑ Iyer RP, Egan W., Regan JB, Beaucage SL 3H-1,2-Benzodithiole-3-on 1,1-dioxide som ett förbättrat sulfuriseringsreagens i fastfassyntesen av oligodeoxiribonukleosidfosforotioater  //  J .Am. Chem. soc. - 1990. - Vol. 112 , nr. 3 . - P. 1253-1254 . - doi : 10.1021/ja00159a059 .
  73. ↑ Vu H., Hirschbein BL Internukleotidfosfitsulfurisering med tetraetyltiuramdisulfid. Fosforotioat-oligonukleotidsyntes via fosforamiditkemi  (engelska)  // Tetrahedron Lett. - 1991. - Vol. 32 , nr. 26 . - P. 3005-3008 . - doi : 10.1016/0040-4039(91)80672-S .
  74. ↑ Efimov VA, Kalinkina AL, Chakhmakhcheva OG, Hill TS, Jayaraman K. Nya effektiva sulfuriseringsreagenser för framställning av oligodeoxiribonukleotidfosfortioatanaloger (ut) // Nucl. Acids Res. - 1995. - T. 23 , nr 20 . - S. 4029-4033 . doi : 10.1093 / nar/23.20.4029 . — PMID 7479060 .
  75. ↑ Ito H., Ike Y., Ikuta S., Itakura K. Fastfassyntes av polynukleotider. VI. Ytterligare studier av polystyrensampolymerer för det fasta underlaget   // Nucl . Acids Res. - 1982. - Vol. 10 , nej. 5 . - P. 1755-1769 . doi : 10.1093 / nar/10.5.1755 .
  76. ↑ Tanaka T., Letsinger RL Sprutmetod för stegvis kemisk syntes av oligonukleotider   // Nucl . Acids Res. - 1982. - Vol. 10 , nej. 10 . - P. 3249-3259 . doi : 10.1093 / nar/10.10.3249 . — PMID 7099961 . Arkiverad från originalet den 6 maj 2022.
  77. ↑ Alvarado-Urbina G., Sathe GM, Liu WC, Gillen MF, Duck PD, Bender R., Ogilvie KK Automatiserad syntes av genfragment   // Science . - 1981. - Vol. 214 , nr. 4518 . - S. 270-274 . - doi : 10.1126/science.6169150 .
  78. ↑ BioAutomation. DNA/RNA-oligonukleotidsyntes: MerMade . Datum för åtkomst: 11 december 2012. Arkiverad från originalet den 16 januari 2013.
  79. ↑ BIOSSET (otillgänglig länk) . Hämtad 11 december 2012. Arkiverad från originalet 3 november 2012. 
  80. ↑ Azco Biotech Inc. Azco DNA/RNA Synthesizers (inte tillgänglig länk) . Hämtad 11 december 2012. Arkiverad från originalet 15 september 2011. 
  81. ↑ Boal JH, Wilk A., Harindranath N., Max EE, Kempe T., Beaucage SL Klyvning av oligodeoxiribonukleotider från glasunderlag med kontrollerade porer och deras snabba avskyddning med gasformiga aminer   // Nucl . Acids Res. - 1996. - Vol. 24 , nr. 15 . - P. 3115-3117 . doi : 10.1093 / nar/24.15.3115 . Arkiverad från originalet den 20 januari 2016.
  82. ↑ Westman E., Strömberg R. Avlägsnande av t-butyldimetylsilylskydd vid RNA-syntes. Trietylamintrihydrofluorid (TEA, 3HF) är ett mer pålitligt alternativ till tetrabutylammoniumfluorid (TBAF  )  // Nucl. Acids Res. - 1994. - Vol. 22 , nr. 12 . - P. 2430-2431 . - doi : 10.1093/nar/22.12.2430 . — PMID 7518583 .
  83. ↑ Capaldi DC, Gaus H., Krotz AH, Arnold J., Carty RL, Moore MN, Scozzari AN, Lowery K., Cole DL, Ravikumar VT Synthesis of High-Quality Antisense Drugs. Tillsats av akrylonitril till fosfortioatoligonukleotider: Karakterisering och undvikande av addukter   // Org . Proc. Res. dev. - 2003. - Vol. 7 , nr. 6 . - s. 832-838 . - doi : 10.1021/op020090n .
  84. ^ Glen Research. Avskyddande - Volym 5 - Avskyddande på kolumn av oligonukleotider i organiska lösningsmedel . Datum för åtkomst: 11 december 2012. Arkiverad från originalet den 16 januari 2013.
  85. ↑ Tillämpade biosystem. Utvärdering och isolering av syntetiska oligonukleotider. Den kompletta guiden (2002). Hämtad 15 april 2013. Arkiverad från originalet 19 april 2013.
  86. ↑ Utvärdera och isolera syntetiska oligonukleotider, 2002 , pp. 2-5-2-6.
  87. ↑ Utvärdera och isolera syntetiska oligonukleotider, 2002 , pp. 3-1-3-19.
  88. ↑ Utvärdera och isolera syntetiska oligonukleotider, 2002 , pp. 4-1-4-15.
  89. ↑ Krotz AH, Gaus H., Hardee GE Bildning av oligonukleotidaddukter i farmaceutiska formuleringar // Farmaceutisk utveckling och teknologi. - 2005. - T. 10 , nr 2 . - S. 283-90 . - doi : 10.1081/PDT-54464 . — PMID 15926677 .
  90. ↑ Willems A., Deforce DL, Van Bocxlaer J. Analys av oligonukleotider med användning av kapillärzonelektrofores och elektrospraymasspektrometri // Methods in Molecular Biology. - Springer, 2008. - T. 384. Kapillärelektrofores. - S. 401-414. — ISBN 978-1-59745-376-9 . - doi : 10.1007/978-1-59745-376-9_14 .

Litteratur

Stora originalverk

  • Caruthers MH Kemisk syntes av DNA och DNA-analoger   // Enl . Chem. Res. - 1991. - Vol. 24 , nr. 9 . - s. 278-284 . doi : 10.1021 / ar00009a005 .
  • Letsinger RL, Mahadevan V. Stegvis syntes av oligodeoxiribonukleotider på en olöslig polymerbärare  //  J. Am. Chem. soc. - 1966. - Vol. 88 , nr. 22 . - P. 5319-5324 . - doi : 10.1021/ja00974a053 . — PMID 10.1021/ja00974a053.

Recensioner

  • Burtscher H., Berner S., Seibl R., Mühlegger K. Nucleic Acids // Ullmanns Encyclopedia of Industrial Chemistry. - Wiley, 2000. - doi : 10.1002/14356007.a18_001 .
  • Iyer RP, Beaucage SL 7.05 Oligonukleotidsyntes // Omfattande naturproduktkemi . - Elsevier, 1999. - S. 105-152.
  • Reese CB Oligo- och polynukleotider: 50 år av kemisk syntes   // Org . Biomol. Chem. - 2005. - Vol. 3 , nr. 21 . - P. 3851-3868 . doi : 10.1039 / b510458k . — PMID 16312051 .

Metoder

Länkar