Immunofluorescensanalys ( MFA - method of fluorescent antibodies , immunofluorescence ) ( eng. Immunofluorescence ) - en uppsättning immunologiska metoder för kvalitativ och kvantitativ bestämning av yt- och intracellulära antigener i prover av cellsuspensioner (cellkulturer, bakterier, mykoplasmor, virusrickettsiaemer, virusrickettsiaemer ). ), blodprover, benhjärna, alveolära tvättningar, tunna vävnadssnitt. Metoden gör det möjligt att analysera biologiska prover i detalj för förekomst av vissa antigena determinanter som är karakteristiska för vissa patogener eller sjukdomar, för att kvantifiera både yt- och intracellulära proteiner och receptorer. Undersökning och utvärdering kan utföras manuellt med ett fluorescerande mikroskop eller automatiserat med en flödescytometer ( flödescytometer ) eller mikrochipcytometer ( chipcytometer ). Det är möjligt att använda ett konfokalmikroskop och ett robotiskt fluorescerande mikroskop (inklusive de kombinerade med en flödescytometer) i kombination med ett mjukvarubildbehandlingssystem. De för närvarande tillgängliga automatiserade teknologierna gör det möjligt att analysera cirka 50 olika antigener i ett prov med hjälp av en uppsättning olika fluorescerande markörer i formatet mycket informativ mikroskopi och cytometri (metoder kallas höginnehållsavbildning , höginnehållscytometri , höginnehållscytometri screening ) och ungefär hälften så mycket den maximala uppsättningen antigener med modern flödescytometri eller konfokalmikroskopi. De huvudsakliga praktiska tillämpningarna är onkologi, mikrobiologi, cellbiologi, genetik, farmakologi, etc.
Kärnan i metoden ligger i visualiseringen av antigenet med specifika antikroppar med fluorescerande markörer. Metoden för konjugering av globuliner med organiska fluorokromer utvecklades 1942 av A. Koons. [1] För närvarande använder metoden både antikroppar mot olika antigener och specifika fläckar för DNA (t.ex. DAPI ), RNA (t.ex. Sybr Green II ), lipider och proteiner.
I den grundläggande MFA-tekniken skiljer man mellan den direkta metoden utvecklad av A. Koons och Melvin Kaplan [2] och den indirekta metoden utvecklad av A. Koons och Wheeler i originalversionen av indirekt MFA med komplement .
I den direkta metoden ( pMPA ) appliceras en lösning av antikroppar direkt märkta med ett fluorescerande färgämne på testberedningen eller cellsuspensionen. Bildandet av ett antigen-antikroppskomplex detekteras av en fluorescerande signal i form av en glöd av varierande grad av intensitet och klarhet.
Med den indirekta metoden ( nMFA ) appliceras antikroppar mot de önskade antigenerna (de så kallade "första" antikropparna) på preparatet och sedan artspecifika "andra" antikroppar mot de "första" antikropparna, vilket undviker ospecifika reaktioner. I detta fall är endast den andra antikroppen konjugerad med ett fluorescerande färgämne. Till exempel, om i studien musantikroppar, mus IgG, används som de "första" antikropparna, används anti-art anti-mus IgG konjugerat med ett fluorescerande färgämne som de "andra". Antigen-antikroppskomplexet producerar fluorescerande färgning först efter bindning till en "andra" antikropp.
Indirekta metoder kräver endast sera av antiglobulinarter med fluorokromer, men kräver ett stort antal testkontroller. Vid inställning med den direkta metoden görs endast en kontroll, även om det i tidigare versioner av metoden krävdes många monospecifika sera. Under lång tid var nackdelarna med direkta typer av MFA begränsad känslighet på grund av närvaron av möjliga korsreaktioner mellan objekt liknande antigena sammansättning och ospecifik fluorescens på grund av adsorptionen av fluorescerande globuliner på olika element i beredningen. För närvarande använda kommersiella standardkonjugat innehållande immunoglobuliner till de studerade antigenerna. Användningen av biomanipulerade immunglobuliner och en hög grad av antikroppsrening gjorde det möjligt att praktiskt taget omintetgöra ospecifika reaktioner, vilket möjliggjorde ytterligare teknisk utveckling av metoden.
Eftersom den direkta metoden för närvarande undviker ospecifika reaktioner, använder automatiserade metoder övervägande den direkta metoden immunfluorescens.
Resultaten av en manuell mikroskopisk bedömning beskrivs i de så kallade "korsningarna" (från ett + till fyra ++++) - en subjektiv gradering av reaktionens svårighetsgrad av forskarens öga. I automatiserade metoder används fotomultiplikatorer eller högkänsliga fluorescerande kameror som en detektor, vilket möjliggör registrering av signalen med hög noggrannhet och ger värdet av den relativa fluorescensnivån (relativt fluorescensförhållande) inom ett brett skalaområde. Det absoluta värdet beräknas med hjälp av kontroller eller antigener med ett känt konstant innehåll i provet. Vid användning av automatiserade metoder utförs databehandling av specialiserade program för bildbehandling och analys av cytometriska data.
Metoden är av avgörande betydelse vid tidig diagnos och behandling av onkologiska sjukdomar (immunohistokemi, onkohematologi), diagnostik av infektionssjukdomar (till exempel bestämning av CD4+-celler i HIV) och ärftliga syndrom. Automatiserade metoder utvecklas intensivt, inklusive områdena höginnehållsavbildning och höginnehållscytometri , kombinerade metoder för cytometri-mikroskopi ( cytometer-mikroskop ), som har utvecklats parallellt sedan 90 -talet , samt metoder för mikrochipcytometri med plasmonholografi [3] där individuella antikroppar är märkta med nanopartiklar.
| Patologi i medicin | |
|---|---|
| patohistologi | Cellskador apoptos Nekrobios karyopynosis karyorrhexis karyolys Nekros koagulativ nekros kollikationsnekros kallbrand kvarstad hjärtattack Cellulär anpassning Atrofi Hypertrofi Hyperplasi Dysplasi Metaplasi skivepitelaktig körtel- Dystrofi Protein fet kolhydrat Mineral |
| Typiska patologiska processer |
|
| Laboratoriediagnostik och obduktion _ |
|