Sekvensering

Den aktuella versionen av sidan har ännu inte granskats av erfarna bidragsgivare och kan skilja sig väsentligt från versionen som granskades den 26 maj 2021; kontroller kräver 2 redigeringar .

Sekvensering av biopolymerer ( proteiner och nukleinsyror  - DNA och RNA ) - bestämning av deras aminosyra- eller nukleotidsekvens (från latin  sequentum  - sekvens). Som ett resultat av sekvensering erhålls en formell beskrivning av den primära strukturen hos en linjär makromolekyl i form av en sekvens av monomerer i textform. Storleken på DNA-segmenten som ska sekvenseras överstiger vanligtvis inte 100 baspar (nästa generations sekvensering) och 1000 baspar för Sanger-sekvensering. Som ett resultat av sekvensering av överlappande DNA-sektioner erhålls sekvenser av gensektioner, hela gener, totalt mRNA eller fullständiga genom från organismer [1] [2] .

För sekvensering används metoderna från Edman , Sanger och andra; för närvarande används Sanger-metoden med dideoxinukleosidtrifosfater ( ddNTP ) vanligen för gensekvensering. Vanligtvis, före sekvensering, amplifieras DNA-sektionen som ska sekvenseras med användning av PCR . Helgenomsekvensering utförs vanligtvis med hjälp av nästa generations sekvenseringsteknologier .

Sanger-sekvensering

Dideoxinukleotidmetoden, eller metoden "kedjeterminering", utvecklades av F. Sanger 1977 och används för närvarande flitigt för att bestämma nukleotidsekvensen för DNA. Sanger-sekvensering hybridiserar en syntetisk oligonukleotid 17–20 nt lång med ett specifikt ställe i en av kedjorna i det sekvenserade stället. Denna oligonukleotid är en primer som tillhandahåller en 3'-hydroxylgrupp för att initiera syntesen av en kedja som är komplementär till mallen.

Primerlösningen är uppdelad i fyra rör, som vart och ett innehåller fyra deoxinukleotider, dATP, dCTP, dGTP och dTTP (varav en är radiomärkt) och en av fyra 2',3'-dideoxinukleotider (ddATP, ddTTP, ddGTP eller ddCTP) . Dideoxinukleotiden ingår i alla positioner i blandningen av växande kedjor, och efter dess vidhäftning upphör kedjetillväxten omedelbart.

Som ett resultat, i vart och ett av de fyra provrören, med deltagande av DNA-polymeras , bildas en unik uppsättning oligonukleotider med olika längder, inklusive primersekvensen. Vidare tillsätts formamid till provrören för att separera kedjorna och elektrofores utförs i en polyakrylamidgel i fyra banor. Utför autoradiografi , vilket gör att du kan "läsa" nukleotidsekvensen för det sekvenserade DNA-segmentet.

I en modernare version är dideoxinukleotider märkta med fyra olika fluorescerande färgämnen och PCR utförs i ett rör. Sedan, under polyakrylamidgelelektrofores, exciterar en laserstråle vid en viss punkt i gelén fluorescensen av färgämnen, och detektorn bestämmer vilken nukleotid som för närvarande migrerar genom gelén. Moderna instrument använder kapillärelektrofores för DNA-sekvensering . [3]

Högeffektiv sekvensering

Se även

Anteckningar

  1. ↑ Alberts B., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K., Watson J. Molecular biology of the cell: in three volumes. - 2. - Moskva: Mir, 1994. - T. 1. - 517 sid. — 10 000 exemplar.  — ISBN 5030019855 .
  2. ↑ Knorre D. G., Myzina S. D. Biologisk kemi. - 3. - Moskva: Högre skola, 2000. - 479 s. - 7000 exemplar.  — ISBN 5060037207 .
  3. ↑ Glik B., Pasternak J. Molecular biotechnology. Principer och tillämpning. - Moskva: Mir, 2002. - 589 sid. — ISBN 5030033289 .

Litteratur

Länkar

  Gå till Wikidata-objektet  Ordböcker och uppslagsverk
 Personlig medicin
Omix datasektioner
Applikationssektioner
Metoder
Relaterade artiklar