Realtidspolymeraskedjereaktion

Realtidspolymeraskedjereaktion (eller kvantitativ PCR, qPCR, PCR-RT, eng.  Realtids-PCR, qPCR ) är en laboratoriemetod baserad på polymeraskedjereaktionsmetoden som låter dig bestämma inte bara närvaron av målnukleotiden sekvens i provet, men även mäta antalet kopior. Mängden amplifierat DNA mäts efter varje amplifieringscykel med användning av fluorescerande märkningar: prober eller interkalatorer . Bedömningen kan vara kvantitativ (mätning av antalet kopior av mallen) och relativ (mått i förhållande till infört DNA eller ytterligare kalibreringsgener ) [ 1] .

En modifierad kvantitativ PCR-metod kallas semikvantitativ PCR (semi-kvantitativ PCR). Det används ofta för att jämföra uttrycket av flera gener. I detta fall mäts mängden ackumulerad produkt endast vid en punkt - efter att reaktionen har stoppats. [2]

Realtids-PCR kombineras ofta med andra metoder: RT-PCR ( RT-qPCR ) , ChIP - qPCR, etc. [3]

Beskrivning av metoden

qPCR-proceduren liknar den klassiska PCR -proceduren , det vill säga att alla steg i reaktionen är närvarande - smältning av dubbelsträngat DNA vid en temperatur på 95˚C, hybridisering av primrar (annealingstemperatur beror på vilka primrar som används) och förlängning vid en temperatur på 72˚C om Taq-polymeras används . Mängden PCR-produkt mäts i varje PCR-cykel med användning av fluorescerande märkningar. Således indikerar styrkan på signalen den initiala mängden av molekylen av intresse [4] .

Amplifieringsplot _

Den nomenklatur som vanligtvis används för qPCR är:

  1. Baslinje är PCR-cykler där den fluorescerande signalen är under det värde som instrumentet kan detektera.
  2. ΔRn är ökningen av den fluorescerande signalen vid varje tidpunkt.
  3. Tröskellinjen är en godtycklig nivå av fluorescens vald baserat på baslinjen. En signal som detekteras över tröskelvärdet anses vara en riktig signal, som kan användas för att bestämma tröskelcykeln (Ct) för provet. Tröskeln kan justeras för varje experiment för att vara i den exponentiella regionen på alla plotter.
  4. Tröskelantalet cykler (Ct) är antalet PCR-cykler vid vilka fluorescensen överskrider tröskelvärdet.

Grafen består av en baslinje, en exponentiell fas och en platå [5] .

I de inledande stadierna är fluorescensen svag, eftersom det finns lite produkt, så det är svårt att skilja den från bakgrunden. När produkten ackumuleras växer signalen exponentiellt först och når sedan en platå. Platån beror på bristen på en eller annan komponent i reaktionen - primers , nukleotidtrifosfater , en fluorescerande märkning kan ta slut. Om för mycket reaktionsprodukt har ackumulerats kan polymeras bli en begränsande faktor , och då blir beroendet av mängden produkt på cykeln linjärt . Det är värt att notera att i en vanlig realtids-PCR-reaktion kommer alla prover att platå och nå ungefär samma signalnivå. Slutpunkten kommer således inte att säga något om den initiala mängden av testprovet. Å andra sidan kan man i den exponentiella fasen spåra skillnader i tillväxthastigheten för mängden produkt. Skillnader i det initiala antalet molekyler påverkar antalet cykler som krävs för att höja fluorescensnivån över brusnivån [5] .

Ct är ett tal som kan användas för att bedöma mängden mål-DNA i lösning, men Ct-värdet kan bero på många slumpmässiga faktorer, såsom detektorkänslighet , filterkvalitet etc. Därför är den exakta initiala mängden av produkten av intresse går inte att mäta. Det finns normaliseringsmetoder för att lösa detta problem . Mät förhållandet mellan mängderna av två molekyler i provet. De normaliseras vanligtvis till produkterna från hushållsgener  - gener, vars antal i en cell alltid är ungefär detsamma (ett exempel är infA-genen, som kodar för translationsinitieringsfaktorn i bakterier ) . Förhållandet bestäms av följande formel:

där och  är de initiala kvantiteterna för de två proverna, Ct B och Ct A  är motsvarande Ct-värden, och  är PCR-effektiviteten, som ofta likställs med eller [5] .

Smältkurvanalys

Realtids-PCR möjliggör identifiering av specifika amplifierade DNA-fragment med hjälp av en analys av deras smält- (denaturerings-) temperatur, även kallat Tm-värdet. Metoden använder interkalerande färgämnen, vanligtvis SYBR Green . Smältpunkten för DNA:t är specifik för det amplifierade fragmentet. Resultaten av denna metod erhölls genom att jämföra dissociationskurvorna för de analyserade DNA-proverna. Två smältkurvor plottas för analys. Den första är beroendet av fluorescens i tid, den andra är hastigheten för fluorescens fall i tid. Toppen speglar ett specifikt DNA-mönster [5] .

Klassificering av använda fluoroforer

Icke-specifik definition: kvantitativ PCR med dubbelsträngade DNA - bindande färgämnen som reportrar

I det här fallet är märkningen en kemisk förening som kan inkorporeras i DNA -dubbelhelixen . En sådan sond ändrar sin konformation vid interaktion med PCR-produkter och blir en fluorofor . Produktbestämning kan utföras i slutet av varje cykel, före denatureringssteget . Ett exempel på en sådan färg är den mycket använda SYBR Green. Dubbelsträngat DNA (dsDNA) färgämnen kommer dock att binda till allt dsDNA, inklusive icke-specifika PCR-produkter (såsom primerdimeren ) . Detta kan potentiellt störa noggrannheten av målsekvensövervakning [6] .

definition: fluorescerande reporterprobe [

Fluorescerande prober detekterar endast den DNA-innehållande sekvens som är komplementär till sonden; därför ökar användningen av en reporterprob avsevärt specificiteten och tillåter mer exakt mätning i närvaro av annat dsDNA . Fluorescerande reporterprober förhindrar dock inte den hämmande effekten av primerdimerer, som kan undertrycka ackumuleringen av målreaktionsprodukter [7] .

Det är också möjligt att använda flera sonder vars fluoroforer har olika emissionsspektra . I det här fallet blir det möjligt att registrera en signal från olika DNA-molekyler i ett rör. Metoden kallas multipel PCR (eng. multiplex PCR ) [8] .

Metoden är baserad på införandet av en DNA-sond som är komplementär till amplifieringsprodukten med en fluorescerande reporter i ena änden av sonden och en fluorescenssläckare i den motsatta änden. När quenchern är i närheten av reportern absorberar den signalen och reportern fluorescerar inte . Under amplifiering bryts sondens integritet och reportern kan detekteras genom fluorescens efter laserexcitation. En ökning av mängden produkt som reportersonden binder till i varje PCR-cykel orsakar därför en proportionell ökning av fluorescensen . Etiketter kan fluorescera i förlängningsfasen eller i PCR-annealingsfasen [4] .

En fluorofor och dess släckare sys på sonden från 5'- och 3' -ändarna . Om sondsekvensen inte är särskilt lång, kommer de även i det DNA-bundna tillståndet att interagera med varandra och ingen fluorescens kommer att emitteras. Under förlängning dissocierar DNA-polymeras , som har 5'-3'-exonukleasaktivitet (används ofta Taq-polymeras ), sonden från mål-DNA en nukleotid i taget. Som ett resultat av denna process kommer både fluoroforen och dess släckare in i lösningen, där sannolikheten för att hitta dessa ämnen i närheten är liten och fluorescensen kommer att återställas [4] .

  1. En fluorogen hårnål  är en liten enkelsträngad DNA-molekyl som i sitt fria tillstånd kan bilda en speciell rumslig struktur av DNA - en hårnål . En fluorofor sys i ena änden av kedjan och ett ämne som släcker den sys i den andra. Sondsekvensen är komplementär till mål-DNA:t. I det här fallet kommer de sondmolekyler som flyter i lösningen inte att ge en fluorescerande signal, och de som är bundna till DNA- molekylerna kommer att genomgå konformationsförändringar , vilket kommer att resultera i rumslig separation av fluoroforen och dess släckare och återställande av fluorescens. Registrering är tillrådligt att utföra efter denaturering [4] .
  2. En etikett baserad på FRET- metoden . Grunden för denna metod är närvaron av två prober som binder till mål-DNA på kort avstånd från varandra. En fluorofordonator och en fluoroforacceptor sys till 5'-änden av en sond respektive 3'-änden av den andra sonden . När de är nära varandra absorberar donatorfluoroforen ljus av en viss våglängd och avger ett sken i ett längre våglängdsspektrum . Denna våg absorberas i sin tur av acceptorfluoroforen och avger det registrerade ljuset. [4] .

Applikation

Realtids-PCR används i stor utsträckning för många forskningsapplikationer i laboratorier. Dessutom har denna metod funnit tillämpning inom medicin (för att diagnostisera sjukdomar) och inom bioteknikområdet (för att bestämma innehållet av mikroorganismer i livsmedel och växtmaterial; för att upptäcka GMO ). qPCR används också för genotypning och kvantifiering av virus och andra mänskliga patogener .

Vetenskaplig forskning

Kvantifiering av genuttryck

qPCR används som en av metoderna för kvantitativa mätningar av gentranskription . Denna metod används i stor utsträckning för att bedöma förändringar i uttrycket av en viss gen över tid , till exempel som svar på administrering av ett läkemedel eller förändringar i miljöförhållanden. Kvantifiering av genuttryck med traditionella DNA-detektionsmetoder är opålitlig. Detektion av mRNA med Northern blöt , gel-PCR-produkter eller Southern blöt tillåter inte exakt kvantifiering. Till exempel, inom 20-40 cykler av en typisk PCR, når mängden DNA-produkt en platå som inte är direkt relaterad till mängden mål- DNA i den initiala PCR [9] .

Realtids-PCR kan användas för att kvantifiera nukleinsyror med två vanliga metoder: relativ kvantifiering och absolut kvantifiering [10] . Absolut kvantifiering ger det exakta antalet mål-DNA-molekyler med hjälp av en standardkurva . Därför är det viktigt att PCR för provet och standarden har samma amplifieringseffektivitet . Relativ poängsättning baseras på interna referensgener ( hushållningsgener ) för att bestämma veckolikheter i målgenexpression. Kvantifieringen uttrycks som en förändring i uttrycksnivåer av mRNA tolkat som komplementärt DNA ( cDNA , genererat av mRNA omvänd transkription ). Relativ kvantifiering är lättare att utföra eftersom den inte kräver en kalibreringskurva eftersom mängden av genen som studeras jämförs med mängden kontrollgen [11] .

qPCR för att bestämma mängden litet nukleärt RNA (snRNA)

Små kärn-RNA (snRNA) skiljer sig i egenskaper från mRNA med en mycket kort längd (cirka 22 nukleotider ), har inte en konservativ sekvens i ändarna, medan snRNA från en population kan skilja sig åt med en eller flera nukleotider . För att lösa dessa problem används tillvägagångssätt baserade på tillägg av en liten bit DNA (linker) till cDNA i en omvänd transkriptionsreaktion . Därefter utförs realtids-PCR med standardmetoder med användning av primers, (biologi)|komplementära till linkern [12] .

Genomiska studier med ChIP-qPCR

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) i kombination med RT-qPCR anses vara den grundläggande metoden inom genomforskning , dess kommersiella tillgänglighet och höga noggrannhet möjliggör snabb och enkel analys av protein-DNA-interaktioner. ChIP-qPCR används för att undersöka specifika gener och potentiella regulatoriska regioner såsom promotorer . Denna metod används för närvarande i olika studier, inklusive celldifferentiering , suppressorgentystnad och effekten av histonmodifieringar på genuttryck [ 13 ] .

ChIP-analys fångar bara en bråkdel av de möjliga målen som finns i genomet på grund av variation i tvärbindningseffektivitet och sterisk begränsning av antikroppstillgänglighet [13] .

För att utföra ChIP-qPCR är det nödvändigt att lägga till mastermixen (en blandning av enzymer och nukleotider ), primrar och mall-DNA. I detta fall är det nödvändigt att noggrant välja koncentrationen av primrar för effektiv amplifiering av mål-DNA. Antingen fungerar ChIP-DNA som en mall eller, i fallet med en negativ kontroll, tomma pärlor utan DNA. Sedan är det nödvändigt att välja tid och temperatur för glödgningscyklerna och starta PCR. Resultaten analyseras på samma sätt som qPCR-resultaten, och jämför tröskelvärdet för antal cykler (Ct) för inmatningsmallen och ChIP DNA-mallen [3] .

Medicinsk diagnostik

Kvantitativ PCR används för att snabbt identifiera gener eller DNA-fragment som är markörer för infektionssjukdomar , genetiska abnormiteter etc. Införandet av denna metod i kliniska laboratorier har avsevärt förbättrat kvaliteten på diagnostisering av infektionssjukdomar [14] . Dessutom används qPCR som ett verktyg för att upptäcka nya sjukdomar. Till exempel nya stammar av influensa [15] .

Användningen av qPCR tillåter också kvantitativa mätningar och genotypning (karakterisering av stammar) av virus , såsom hepatit B-virus [16] . Graden av infektion , som mäts som antalet kopior av virusgenomet per vävnadsenhet hos patienten, är av stor betydelse. Till exempel beror sannolikheten för reaktivering av herpes simplex-virus typ 1 på antalet infekterade ganglier [17] .

Hos patienter med misstänkt coronavirusinfektion tas en svalgpinne, RNA extraheras och analyseras med RT-qPCR . Målgenerna är den öppna läsramen 1ab (ORF1ab) och nukleokapsidproteinet (N). En cykeltröskel (Ct-värde) på mindre än 37 definieras som ett positivt testresultat och ett Ct-värde på 40 eller mer definieras som ett negativt testresultat. Dessa diagnostiska kriterier är baserade på rekommendationer från National Institute for Control and Prevention of Viral Diseases [18] .

Känsligheten för RT-qPCR- testet är 83,3 %, detta test är benäget att få falskt negativa resultat . Datortomografi används också för att diagnostisera coronavirus , vars känslighet är mycket högre och uppgår till 97,2 % [19] .

Kvantitativ PCR används också i stor utsträckning för att upptäcka tumörceller i solida tumörer [20] [21] och även i vissa former av leukemi [22] [23] .

qPCR hjälper till att upptäcka cirkulerande tumörceller . Till exempel är bröstcancer fortfarande den vanligaste dödsorsaken bland cancerpatienter. Dessutom orsakas döden ofta av metastaser som har uppstått . Metastaser uppstår som ett resultat av att celler som kan föröka sig separeras från tumören , kommer in i blodomloppet och sätter sig igen i någon del av kroppen. Dessa celler kallas cirkulerande stamceller (CSC). Närvaron av sådana celler i blodet hos patienter med bröstcancer är som regel förknippad med en dålig prognos för resultatet av terapi och överlevnad i allmänhet, därför är det en mycket viktig diagnostisk parameter.  Men på grund av det mycket låga antalet är det en svår uppgift att identifiera CVT .

Och qPCR som en mycket känslig metod kan användas för att lösa detta problem. CSTs är av epitelialt ursprung och uttrycker därför en viss uppsättning gener som skiljer sig från blodkropparna som omger dem , som är av mesenkymalt ursprung. För att tillämpa denna metod är det nödvändigt att bestämma uppsättningen av CST-markörgener och utvärdera deras uttrycksnivå [24] .

I mikrobiologi

Realtids-PCR används även för mikrobiologiskt arbete inom området livsmedelssäkerhet, för att bedöma kvaliteten på vatten (dricks- och avloppsvatten) och inom folkhälsoområdet [25] . Dessutom används denna metod för att identifiera tarmmikrofloran [26] .

Detektion av fytopatogener

Agroindustrin producerar patogenfria frön och plantor för att förhindra ekonomiska förluster och öka produkternas hållbarhet. Därför har system utvecklats för att upptäcka små mängder phytophthora ( Phytophthora ramorum ), oomycete och några andra patogener som dödar ekar och andra växtarter blandade med värdväxt-DNA. Förmågan att skilja mellan patogenens och värdväxtens DNA är baserad på amplifieringen av ITS-sekvenser ( intern transkriberad spacer) , interna transkriberade regioner belägna i den kodande regionen av den ribosomala RNA -genen , som är karakteristiska för varje taxon [27] ] .

Identifiering av genetiskt modifierade organismer

qPCR (med omvänd transkription ) kan användas för att detektera genetiskt modifierade organismer , eftersom det är känsligare än många andra metoder. I detta fall används specifika primrar för att amplifiera promotorn, terminatorn eller intermediära sekvenser som används i vektorbildningsprocessen . Eftersom processen att skapa en transgen växt vanligtvis resulterar i införandet av mer än en kopia av transgenen , uppskattas dess mängd också vanligtvis med hjälp av qPCR. I detta fall används en växt som innehåller denna gen i en enda kopia som kontroll [28] [29] .

Anteckningar

  1. ↑ VanGuilder HD, Vrana KE, Freeman WM Tjugofem år av kvantitativ PCR för  genuttrycksanalys //  Biotechniques : journal. - 2008. - Vol. 44 . - s. 619-626 . - doi : 10.2144/000112776 . — PMID 18474036 .
  2. ↑ Selma Gouvêa-Barros, Maria do Carmo Bittencourt-Oliveira. Semi-kvantitativ PCR för kvantifiering av hepatotoxiska cyanobakterier  // Journal of Environmental Protection. - 2012. - T. 03 , nr. 05 . — S. 426–430 . — ISSN 2152-2219 2152-2197, 2152-2219 . - doi : 10.4236/jep.2012.35053 .
  3. ↑ 1 2 Tae Hoon Kim, Job Dekker. ChIP–Quantitative Polymerase Chain Reaction (ChIP-qPCR)  (engelska)  // Cold Spring Harbor Protocols. — 2018-05. — Vol. 2018 , iss. 5 . - P.pdb.prot082628 . - ISSN 1559-6095 1940-3402, 1559-6095 . - doi : 10.1101/pdb.prot082628 .
  4. ↑ 1 2 3 4 5 Provenzano M. , Mocellin S. Kompletterande tekniker: validering av genuttrycksdata genom kvantitativ realtids-PCR.  (engelska)  // Framsteg inom experimentell medicin och biologi. - 2007. - Vol. 593 . - S. 66-73 . - doi : 10.1007/978-0-387-39978-2_7 . — PMID 17265717 .
  5. ↑ 1 2 3 4 Kubista M. , Andrade JM , Bengtsson M. , Forootan A. , Jonák J. , Lind K. , Sindelka R. , Sjöback R. , Sjögreen B. , Strömbom L. , Ståhlberg A. , Zoric N. Realtidspolymeraskedjereaktionen .  (engelska)  // Molecular Aspects Of Medicine. - 2006. - April ( vol. 27 , nr 2-3 ). - S. 95-125 . - doi : 10.1016/j.mam.2005.12.007 . — PMID 16460794 .
  6. ↑ Xiujuan Peng, Alex Nguyen, Debadyuti Ghosh. Kvantifiering av M13 och T7 bakteriofager av TaqMan och SYBR green qPCR  (engelska)  // Journal of Virological Methods. — 2018-02. — Vol. 252 . — S. 100–107 . — ISSN 0166-0934 . - doi : 10.1016/j.jviromet.2017.11.012 .
  7. ↑ E. Navarro, G. Serrano-Heras, M.J. Castaño, J. Solera. PCR-detektionskemi i realtid  (engelska)  // Clinica Chimica Acta. — 2015-01. — Vol. 439 . — S. 231–250 . - doi : 10.1016/j.cca.2014.10.017 . Arkiverad 1 maj 2020.
  8. ↑ Steve F. C. Hawkins, Paul C. Guest. Multiplexanalyser med kvantitativ PCR i realtid  //  Multiplexa biomarkörtekniker. — New York, NY: Springer New York, 2016-11-29. — S. 125–133 . - ISBN 978-1-4939-6729-2 , 978-1-4939-6730-8 .
  9. ↑ L. Overbergh, A. Giulietti, D. Valckx, R. Decallonne, R. Bouillon. Användningen av omvänt transkriptas i realtid PCR för kvantifiering av cytokin-genuttryck  // Journal of biomolecular techniques: JBT. — 2003-03. - T. 14 , nej. 1 . — s. 33–43 . — ISSN 1524-0215 . Arkiverad från originalet den 29 april 2016.
  10. ↑ S. Dhanasekaran, T. Mark Doherty, John Kenneth, TB Trials Study Group. Jämförelse av olika standarder för realtids-PCR-baserad absolut kvantifiering  // Journal of Immunological Methods. — 2010-03-31. - T. 354 , nr. 1-2 . — s. 34–39 . — ISSN 1872-7905 . - doi : 10.1016/j.jim.2010.01.004 . Arkiverad från originalet den 2 mars 2019.
  11. ↑ Livsteknologier (Thermo Fisher Scientific). Realtids PCR-handbok / Life Technologies (Thermo Fisher Scientific). — Life Technologies (Thermo Fisher Scientific). - 2014. - S. 40-43. — 68 s.
  12. ↑ Benes V. , Castoldi M. Expressionsprofilering av mikroRNA med hjälp av kvantitativ PCR i realtid, hur man använder den och vad som finns tillgängligt.  (engelska)  // Metoder (San Diego, Kalifornien). - 2010. - April ( vol. 50 , nr 4 ). - S. 244-249 . - doi : 10.1016/j.ymeth.2010.01.026 . — PMID 20109550 .
  13. ↑ 12 Patrik Asp. Hur man kombinerar chip med qPCR  //  Chromatin Immunoprecipitation / Neus Visa, Antonio Jordán-Pla. - New York, NY: Springer New York, 2018. - Vol. 1689 . — S. 29–42 . - ISBN 978-1-4939-7379-8 , 978-1-4939-7380-4 . - doi : 10.1007/978-1-4939-7380-4_3 .
  14. ↑ Sails AD (2009). Tillämpningar inom klinisk mikrobiologi. Realtids-PCR: Aktuell teknik och applikationer . Caister Academic Press. ISBN 978-1-904455-39-4
  15. ↑ FDA godkänner akut användning av influensamediciner, diagnostiskt test som svar på svininfluensautbrott hos människor. FDA News, 27 april 2009.
  16. ↑ Yeh SH , Tsai CY , Kao JH , Liu CJ , Kuo TJ , Lin MW , Huang WL , Lu SF , Jih J. , Chen DS , Chen PJ Kvantifiering och genotypning av hepatit B-virus i en enda reaktion med realtids-PCR och smältkurvanalys.  (engelska)  // Journal of Hepatology. - 2004. - Oktober ( vol. 41 , nr 4 ). - s. 659-666 . - doi : 10.1016/j.jhep.2004.06.031 . — PMID 15464248 .
  17. ↑ Sawtell NM Sannolikheten för in vivo-reaktivering av herpes simplex-virus typ 1 ökar med antalet latent infekterade neuroner i ganglierna.  (engelska)  // Journal Of Virology. - 1998. - August ( vol. 72 , nr 8 ). - P. 6888-6892 . — PMID 9658140 .
  18. ↑ Dawei Wang, Bo Hu, Chang Hu, Fangfang Zhu, Xing Liu. Kliniska egenskaper hos 138 sjukhusvårdade patienter med 2019 ny coronavirusinfekterad lunginflammation i Wuhan, Kina   // JAMA . — 2020-03-17. — Vol. 323 , utg. 11 . - S. 1061 . — ISSN 0098-7484 . doi : 10.1001 / jama.2020.1585 . Arkiverad 1 april 2020.
  19. ↑ Chunqin Long, Huaxiang Xu, Qinglin Shen, Xianghai Zhang, Bing Fan. Diagnos av Coronavirus-sjukdomen (COVID-19): rRT-PCR eller CT?  (engelska)  // European Journal of Radiology. — 2020-05. — Vol. 126 . — S. 108961 . doi : 10.1016 / j.ejrad.2020.108961 . Arkiverad 14 maj 2020.
  20. ↑ Cen P. , Ni X. , Yang J. , Graham DY , Li M. Cirkulerande tumörceller vid diagnos och hantering av pankreascancer.  (engelska)  // Biochimica Et Biophysica Acta. - 2012. - December ( vol. 1826 , nr 2 ). - S. 350-356 . - doi : 10.1016/j.bbcan.2012.05.007 . — PMID 22683404 .
  21. ↑ Young R. , Pailler E. , Billiot F. , Drusch F. , Barthelemy A. , Oulhen M. , Besse B. , Soria JC , Farace F. , Vielh P. Circulating tumor cells in lungcancer.  (engelska)  // Acta Cytologica. - 2012. - Vol. 56 , nr. 6 . - s. 655-660 . - doi : 10.1159/000345182 . — PMID 23207444 .
  22. ↑ Brüggemann M. , Gökbuget N. , Kneba M. Akut lymfoblastisk leukemi: övervakning av minimal kvarvarande sjukdom som en terapeutisk princip.  (engelska)  // Seminars In Oncology. - 2012. - Februari ( vol. 39 , nr 1 ). - S. 47-57 . - doi : 10.1053/j.seminoncol.2011.11.009 . — PMID 22289491 .
  23. ↑ DiNardo CD , Luger SM Bortom morfologi: minimal återstående sjukdomsdetektion vid akut myeloid leukemi.  (engelska)  // Current Opinion In Hematology. - 2012. - Mars ( vol. 19 , nr 2 ). - S. 82-88 . - doi : 10.1097/MOH.0b013e3283501325 . — PMID 22314322 .
  24. ↑ Andergassen U. , Kölbl AC , Hutter S. , Friese K. , Jeschke U. Detektion av cirkulerande tumörceller från blod från bröstcancerpatienter via RT-qPCR.  (engelska)  // Cancers. - 2013. - 25 september ( vol. 5 , nr 4 ). - P. 1212-1220 . - doi : 10.3390/cancers5041212 . — PMID 24202442 .
  25. ↑ Filion, M (redaktör) (2012). Kvantitativ realtids-PCR i tillämpad mikrobiologi Caister Academic Press. ISBN 978-1-908230-01-0 .
  26. ↑ Nobre Giselle , S. Miglioranz Lucia Helena. Probiotika: effekterna på människors hälsa och nuvarande framtidsutsikter   // Probiotika . - 2012. - 3 oktober. — ISBN 9789535107767 . - doi : 10.5772/50048 .
  27. ↑ Baldwin BG Fylogenetisk användbarhet av de interna transkriberade spacers av nukleärt ribosomalt DNA i växter: ett exempel från kompositerna.  (engelska)  // Molecular Phylogenetics And Evolution. - 1992. - Mars ( vol. 1 , nr 1 ). - S. 3-16 . — PMID 1342921 .
  28. ↑ Holst-Jensen A. , Rønning SB , Løvseth A. , Berdal KG PCR-teknologi för screening och kvantifiering av genetiskt modifierade organismer (GMO).  (engelska)  // Analytisk och bioanalytisk kemi. - 2003. - April ( vol. 375 , nr 8 ). - P. 985-993 . - doi : 10.1007/s00216-003-1767-7 . — PMID 12733008 .
  29. ↑ Brodmann PD , Ilg EC , Berthoud H. , Herrmann A. Kvantitativa polymeraskedjereaktionsmetoder i realtid för fyra genetiskt modifierade majssorter och majs-DNA-innehåll i livsmedel.  (engelska)  // Journal Of AOAC International. - 2002. - Maj ( vol. 85 , nr 3 ). - s. 646-653 . — PMID 12083257 .

Litteratur

  • Glick B., Pasternak J. Molecular biotechnology. Principer och tillämpning. - Moskva: Mir, 2002. - 589 sid. — ISBN 5030033289 .