Systematisk utveckling av ligander genom exponentiell anrikning ( engelska SELEX från Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment ) är en kombinatorisk kemimetod som används inom molekylärbiologi för att erhålla oligonukleotider ( korta enkelsträngade RNA eller DNA- molekyler ) som specifikt binder till en specifik ligand ligander). Sådana oligonukleotider kallas aptamerer [1] [2] [3] . Oftast kallas denna metod för SELEX, men det finns även förkortningar SAAB (från engelskan selected and amplified binding site - selected and amplified binding site ) och CASTing (från engelskan. cyclic amplification and selection of targets - cyclic amplification and selection of mål) [4] [5] . SELEX utvecklades 1990. 2015 ägnade Journal of Molecular Evolution ett specialnummer åt denna metod i samband med 25-årsjubileet av dess uppfinning [6] .
Processen börjar med syntesen av ett mycket stort bibliotek av -oligonukleotider, bestående av slumpmässiga sekvenser med fixerad längd med konstanta 5'- och 3'-regioner som fungerar som primer -annealingsställen (dvs komplementär bindning av primrar till mall). Vidare interagerar oligonukleotiderna som ingår i biblioteket med liganden av intresse för forskaren (oftast ett protein eller en liten organisk förening ). De oligonukleotider som inte kunde binda till liganden avlägsnas med affinitetskromatografi eller magnetiska pärlor [7] . Oligonukleotider bundna till liganden elueras, amplifieras genom polymeraskedjereaktion (PCR) och utsätts för efterföljande selektionsomgångar för att välja molekyler med den högsta affiniteten för liganden [2] [3] .
SELEX-metoden har redan framgångsrikt använts för att utveckla ett antal aptamerer för kliniska och forskningsändamål [8] . SELEX har också använts för att generera aptamerer med nukleotider som innehåller kemiskt modifierade sockerarter eller kvävehaltiga baser . Modifierade nukleotider kan ge aptamerer ytterligare bindningsförmåga och även öka deras stabilitet [9] .
Det första steget i SELEX är skapandet av ett stort bibliotek av oligonukleotider med en fast längd, men helt eller delvis slumpmässiga sekvenser. Emellertid måste regioner med en variabel sekvens flankeras av regioner med en fixerad sekvens för att kunna amplifieras med PCR. Oligonukleotider framställs initialt genom kemisk syntes och amplifieras sedan med PCR så att varje slumpmässig sekvens är närvarande i flera kopior i biblioteket. I fallet med RNA-aptamerer utförs in vitro - transkription av slumpmässiga sekvenser. Det höga antalet kopior av varje slumpmässig sekvens minskar sannolikheten för att ett potentiellt bindningsställe kommer att gå förlorat på grund av stokastiska skäl. För att oligonukleotider ska kunna förvärva en nativ rumslig struktur omvandlas de till en enkelsträngad form och först efter det inkuberas de med målliganden [2] [3] [10] .
Omedelbart före tillsats av oligonukleotiderna till liganden värms biblioteket av enkelsträngade oligonukleotider och kyls långsamt så att de får en termodynamiskt stabil sekundär och tertiär struktur [3] [7] . Slumpsekvensbiblioteket (randomiserat bibliotek) inkuberas sedan med den immobiliserade målliganden för att tillåta aptamererna att binda till den. Protokollen för att inkubera ett bibliotek med en ligand kan variera, i synnerhet olika tillvägagångssätt för immobilisering av ligander, separering av obundna oligonukleotider , olika inkubationstider och temperaturer , inkubationsbuffertar och koncentrationsförhållanden för oligonukleotider och ligander kan användas. Ligander immobiliseras på affinitetskromatografikolonner [3] , nitrocellulosafilter [ 2] eller magnetiska pärlor [7] . En variant av SELEX har också utvecklats som använder hela cellen som ligand . I detta fall sker inkubationen av oligonukleotidbiblioteket direkt i odlingsskålarna där cellerna växer [11] . Sammansättningen av bufferten i vilken inkubationen sker beror på ligandens egenskaper och kraven på framgångsrikt valda aptamerer. Till exempel, om liganden är en negativt laddad liten molekyl eller protein, används buffertar med hög salthalt för att främja bindning av aptameren till liganden. Om det krävs för att erhålla en aptamer som binder till ett protein in vivo eller till en hel cell, som är planerad att användas för diagnostiska eller terapeutiska ändamål, används buffertar för inkubation som är nära blodplasma i saltkoncentrationer , och själva processen utförs vid fysiologiska temperaturer för att de utvalda aptamererna med största sannolikhet skulle binda till liganden exakt in vivo . Inkubationsbuffertar kan också innehålla icke-specifika konkurrenter. Om det finns en stor sannolikhet att oligonukleotider som inte binder till liganden ändå kommer att finnas kvar i reaktionsblandningen på grund av ospecifik bindning till mallen, kommer icke-specifika konkurrenter (små molekyler eller polymerer som i egenskaper liknar biblioteksoligonukleotider) att förhindra ospecifik retention av olämpliga aptamerer i reaktionsblandningen [11] . Egenskaperna för utvalda aptamerer kan också bero på förhållandet mellan ligand- och oligonukleotidkoncentrationer. Om forskaren inte står inför uppgiften att erhålla aptamerer med en mycket stark affinitet för liganden, är det värt att använda ett överskott av liganden för att öka sannolikheten för att åtminstone några oligonukleotider kommer att kunna binda till den. Men om det däremot krävs en mycket specifik aptamer som starkt binder liganden, bör oligonukleotider tas i överskott. Detta kommer att skapa konkurrens mellan aptamerer och förutsättningar för valet av den lämpligaste av dem [2] .
Efter att biblioteket av oligonukleotider har inkuberats med liganden under en tillräcklig tid, tvättas de obundna oligonukleotiderna bort, medan de bundna förblir bundna till den immobiliserade liganden [3] . När de obundna sekvenserna avlägsnas är det nödvändigt att eluera de bundna aptamererna genom att bryta dess bindning med den immobiliserade liganden. För eluering skapas denaturerande förhållanden under vilka aptamererna förlorar sin rumsliga struktur, förlorar sina bindningar med liganden och tvättas ut med avjoniserat vatten [3] . Denaturerande förhållanden skapas av lösningar som innehåller urea eller EDTA [11] [12] , såväl som av hög temperatur eller fysisk påverkan. Efter eluering utsätts de frigjorda oligonukleotiderna för omvänd transkription om de är RNA eller om modifierade nukleotider behöver införas [2] [3] [11] , och DNA-nukleotiderna samlas helt enkelt in för ytterligare amplifiering [13] . De erhållna DNA-fragmenten amplifieras ytterligare med PCR och omvandlas till enkelsträngat DNA (ssDNA), RNA eller basmodifierad oligonukleotid, som kommer att användas för nästa urvalsomgång [2] [3] .
Nästa steg i SELEX är att erhålla ssDNA, som kommer att användas för ytterligare amplifiering med PCR. Ett av de enklaste sätten att erhålla ssDNA är att använda biotinylerade omvända primrar för PCR, på grund av vilka de syntetiserade komplementära DNA-strängarna kommer att bära biotin. Med hjälp av biotin kan de fixeras till hartset, och den andra strängen av duplexet kan elueras med en alkalilösning . En annan metod för att erhålla ssDNA är asymmetrisk PCR , där den framåtriktade primern tas i överskott och den omvända primern tas i en mycket liten mängd, på grund av vilken fler enkelsträngade fragment syntetiseras. En nackdel med asymmetrisk PCR är att efter PCR måste den enkelsträngade produkten rensas från dubbelsträngat DNA och andra främmande fragment. Onödiga kedjor kan förstöras enzymatiskt efter att ha märkt dem tidigare så att de till exempel känns igen av lambda-exonukleas . Enzymer kommer att förstöra den onödiga strängen och mål-ssDNA:t förblir intakt [2] [3] .
För att öka specificiteten hos aptamerer som väljs med SELEX, kan ett ytterligare steg, negativt urval, införas omedelbart före eller omedelbart efter inkubation. Detta steg behövs för att ta bort sekvenser från blandningen som inte binder till liganden, utan till matrisen på vilken den är immobiliserad [12] [14] [13] . Negativ selektion består i att lägga till ligandanaloger, icke-specifika proteiner och andra molekyler till blandningen, som samlar alla icke-specifika oligonukleotider [11] [13] [15] .
För att övervaka utvecklingen av SELEX kan man jämföra antalet ligandmolekyler som interagerar med aptamererna, vilket är relaterat till antalet eluerade oligonukleotider, med det totala antalet oligonukleotider som teoretiskt elueras i varje steg. Antalet eluerade oligonukleotider uppskattas genom att mäta absorbansen vid en våglängd av 260 nm , eller genom att använda fluorescensmärkta oligonukleotider. När SELEX-processen tar slut når andelen oligonukleotider som binder till aptameren 100 % och antalet eluerade oligonukleotider blir lika med (eller något mindre än) storleken på biblioteket som används i inkubationen [3] [16 ] ] .
För närvarande använder SELEX kemiskt modifierade nukleotider. Närvaron av kemiskt modifierade nukleotider i oligonukleotider kan ge ytterligare fördelar för potentiella aptamerer, såsom att öka deras stabilitet och resistens mot nukleaser , förbättra bindningen till specifika mål, ändra fysikaliska egenskaper (till exempel öka hydrofobiciteten ) och öka antalet möjliga rumsliga strukturer för en given oligonukleotid. Nukleotider med onaturliga kvävebaser har redan använts i SELEX, och i vissa fall, tack vare deras användning, var det möjligt att erhålla DNA-aptamerer med hög affinitet för målet [8] [9] [17] .
SELEX designades för att producera, genom riktad evolution, aptamerer med mycket hög affinitet för specifika ligander, inklusive små molekyler som ATP [18] och adenosin [10] [19] , såväl som proteiner (till exempel prioner [20] och vaskulär endoteltillväxtfaktor (VEGF) [21] ). SELEX används för att generera aptamerer med hög affinitet för mer komplexa strukturer såsom tumörceller [22] . Aptamerer utvecklas som specifikt binder tumörmarkörer [23] , grönt fluorescerande protein och relaterade fluoroforer [24] . FDA har redan godkänt en VEGF-bindande aptamer känd som pegaptanib för behandling av makuladegeneration [21] [25] . SELEX har använts för att producera mycket specifikt katalytiskt DNA (DNA-zymer). Flera metallspecifika DNA-vintrar är kända [26] , inklusive DNA-vintrar som är specifika för koppar [27] , uran [28] och natrium [29] . Biosensorer baserade på aptamerer utvecklas [30] ; dessutom är de planerade att användas för fluorescerande märkning av proteiner [31] och celler [32] , samt selektiv hämning av enzymer [33] .