Alternativ splitsning är en variant av messenger RNA (mRNA) splitsning , där flera mogna mRNA bildas under genuttryck baserat på samma primära transkript (pre-mRNA). Strukturella och funktionella skillnader i de resulterande transkripten kan orsakas av både den selektiva inkluderingen av exoner av det primära transkriptet i moget mRNA och bevarandet av delar av introner i det [1] [2] . Den vanligaste typen av alternativ splitsning involverar exonhoppning : individuella exoner av transkriptet under vissa förhållanden kan antingen inkluderas i det mogna mRNA:t eller hoppa över [3] .
Proteiner som produceras genom translation av sådana mRNA resulterar i olika aminosyrasekvenser ; sålunda, vid alternativ splitsning, säkerställer ett transkript syntesen av flera proteiner. Den utbredda förekomsten av sådan splitsning i eukaryoter leder till en signifikant ökning av mångfalden av proteiner som kodas i deras genom [4] . Till exempel syntetiserar människokroppen minst 100 tusen olika proteiner, medan antalet gener som kodar för dem är cirka 20 tusen (mer än 75 % av alla mänskliga gener som innehåller introner fungerar som mallar för syntesen av pre-mRNA, som är ytterligare alternativ skarvning) [1] [2] .
Bildandet av alternativt splitsade mRNA är under kontroll av ett system av transverkande proteiner ( splitsningsfaktorer ) som binder till cis- ställena i det primära transkriptet. Bland splitsningsfaktorer särskiljs splitsningsaktivatorer och repressorer : de förra främjar användningen av sina individuella platser, medan de senare tvärtom förhindrar deras användning. Mekanismerna för alternativ splitsning är mycket olika, kunskap om "splitsningskoden" gör det möjligt att förutsäga resultatet av splitsningen av en viss gen under vissa förhållanden [5] [6] .
Alternativa skarvningsavvikelser leder ofta till sjukdom; många mänskliga genetiska sjukdomar orsakas av dessa anomalier [5] . Forskare tror att avvikande skarvning kan bidra till utvecklingen av cancer , och det har visat sig att i olika typer av cancer, muterar skarvningsfaktorgener ofta , vilket leder till störningar av det normala skarvningsförloppet [7] [8] [9] [ 10] . Det har också konstaterats att alternativa splitsningsavvikelser bidrar till utvecklingen av kroppens motståndskraft mot kemoterapi [11] .
Alternativ splitsning beskrevs första gången 1977 i adenovirus [12] [13] . Adenovirus har visat sig producera fem olika transkript tidigt i infektionscykeln , före virus -DNA- replikation och ytterligare ett efter att DNA-replikeringen har börjat; medan bildandet av tidiga primära transkript fortsätter efter starten av DNA-replikationen. Ett ytterligare enstaka transkript, bildat i de senare stadierna av den infektionscykeln, läses från 5/6 av det 32 kb stora adenovirala genomet. Det sena transkriptet är mycket längre än något av de tidiga virala transkripten. Forskarna visade att det primära transkriptet som produceras av adenovirus typ 2 i de sena stadierna av infektion skarvas på olika sätt, vilket leder till bildandet av mRNA som kodar för olika virala proteiner. Dessutom innehåller det primära transkriptet flera polyadenyleringsställen , vilket resulterar i olika 3'-ändar för olika mRNA [14] [15] [16] .
1981 beskrevs alternativ splitsning i en cellulär eukaryot gen. I däggdjursceller har ett sådant alternativ visat sig åtfölja bildandet av hormonet kalcitonin . Det primära transkriptet av kalcitoningenen innehåller 6 exoner; det mogna mRNA:t som kodar för kalcitonin inkluderar exon 1-4, och polyadenyleringssignalen är belägen i exon 4. I ett annat mRNA bildat från samma primära transkript hoppas exon 4 över under splitsningen, och det mogna mRNA innehåller exon 1-3, 5, och 6 Den kalcitoningenrelaterad peptid [ 17 ] [18] . Alternativ splitsning i däggdjursimmunoglobulingener upptäcktes också i början av 1980-talet [14] [19] .
Efterföljande studier har visat att alternativ splitsning är vanlig bland alla eukaryoter [3] . Samtidigt kan antalet proteinisoformer som kan översättas från en gen vara ganska betydande. Således har det beräknats att genen från fruktflugan Drosophila melanogaster , känd som DSCAM , när den kombineras oberoende i mRNA från alla tillgängliga exoner, potentiellt kan tillhandahålla syntesen av 38 016 isoformer [20] .
Det finns fem alternativa skarvningsmodeller [3] [4] [5] [21] [22] :
Förutom de fem huvudmodellerna för alternativ splitsning är två metoder kända för att erhålla flera proteiner från en gen som ett resultat av användningen av flera promotorer och flera polyadenyleringsställen . Användningen av multipla promotorer handlar dock mer om transkriptionell reglering än alternativ splitsning. Utgående från transkription från olika punkter är det möjligt att erhålla transkript med olika 5'-ändeexoner. Å andra sidan leder användningen av multipla polyadenyleringsställen till bildningen av olika 3'-ändar i mogna transkript. Båda dessa mekanismer, i kombination med fem splitsningsmönster, tillhandahåller mångfalden av mRNA som läses från samma gen [3] [5] .
En transkription kan genomgå mer än en typ av alternativ splitsning [22] . De modeller som diskuterats ovan beskriver de grundläggande skarvningsmekanismerna väl, men kanske inte är lämpliga för komplexa fall. Till exempel visar figuren till höger tre skarvade former av mushyaluronidas 3-genen. Jämförelse av exoner av den första formen (grön) och den andra (gul) indikerar att intronen bevarades i det slutliga transkriptet, och jämförelse av den andra formen med den tredje (blå) visar exonhoppning [21] .
Pre-mRNA transkriberat från DNA innehåller både exoner och introner, och antalet och längden av introner, som skapar den nödvändiga bakgrunden för alternativ splitsning, varierar avsevärt i olika eukaryoter. Således är det genomsnittliga antalet introner per en introninnehållande gen i modellorganismer 2,5 i Drosophila melanogaster , 4,2 i Caenorhabditis elegans och 4,8 i Arabidopsis thaliana ; hos däggdjur varierar den från 5,7 till 7,8 [24] . Under splitsning måste exoner lämnas kvar i transkriptet och introner tas bort. Regleringen och urvalet av splitsningsställen tillhandahålls av transverkande splitsningsaktivatorproteiner och repressorer, såväl som cis -verkande element som finns i själva pre-mRNA:t - splitsningsförstärkare och ljuddämpare [25] .
Typiska eukaryota introner innehåller konsensussekvenser ; sålunda, vid 5'-änden av varje intron finns det en dinukleotid GU, bredvid 3'-änden finns det en "grenpunkt", där nukleotiden A alltid är närvarande , och sekvenserna som ligger runt den varierar. Hos människor finns det en konsensussekvens kring grenpunkten yUnAy [26] . Efter förgreningspunkten finns en serie pyrimidiner ( polypyrimidinkanalen ), och 3'-änden av intronen ser ut som AG [5] .
Splitsning av pre-mRNA utförs av ett RNA- proteinkomplex känt som spliceosomen . Splitsosomen inkluderar små nukleära ribonukleoproteiner (snRNPs) betecknade U1 , U2 , U4 , U5 och U6 (U3-ribonukleotiden är inte involverad i mRNA-splitsning) [23 ] [27] . Ribonukleotid U1 binder till den 5'-terminala dinukleotiden GU, och U2, med deltagande av proteinfaktorer U2AF, binder till grenpunkten (i detta skede kallas komplexet spliceosom A-komplexet). Under bildandet av A-komplexet bestäms 5'- och 3'-gränserna för det borttagna intronet, liksom ändarna av exonerna som ska vara kvar [5] .
Vidare binder komplexet U4, U5, U6 till A-komplexet. Därefter ersätter U6 U1, och U1 och U4 lämnar komplexet. Det återstående komplexet genomgår två transesterifieringsreaktioner . Under den första reaktionen skärs 5'-änden av intronen av från den överliggande exonen och fästs vid förgreningspunkten till nukleotid A med hjälp av en 2',5'- fosfodiesterbindning , vilket resulterar i att intronen tar formen av ett lasso . Den andra reaktionen skär av 3'-änden av intronen och förenar två exoner med en fosfodiesterbindning; medan intronet släpps och förstörs [3] [23] .
Splitsning regleras av transverkande proteiner ( aktivatorer och repressorer ) och motsvarande cis -regulatoriska element ( ljuddämpare och förstärkare ) på pre-mRNA. Det finns dock bevis för att splitsningsfaktorns verkan i många fall beror på dess position: när splitsningsfaktorn är associerad med ett intronförstärkarelement, fungerar den som en splitsningsaktivator och när den binder till ett regulatoriskt ställe i exonet. , den fungerar som en repressor [25] . Splitsningsreglering involverar också den sekundära strukturen av pre-mRNA, vilket säkerställer effektiv konvergens av två regulatoriska element med varandra eller maskerar de sekvenser som skulle kunna fungera som bindningsställen för splitsningsfaktorer [28] [29] . Tillsammans bildar dessa element en "skarvningskod" som bestämmer hur splitsningen kommer att fortgå under givna cellulära förhållanden [30] [31] .
Två typer av cis -aktiverande element är kända i pre-mRNA och motsvarar transaktiverande RNA-bindande proteiner. Skarvningsljuddämpare är element som de tystande repressorproteinerna binder till, vilket minskar sannolikheten för att en skarvningsplats kommer att finnas i närheten. Placeringen av skarvningsljuddämpare kan vara antingen introner (intron skarvningsljuddämpare, ISS) eller exoner (exoniska skarvningsljuddämpare, ESS). Deras nukleotidsekvenser, såväl som proteinerna som binder till dem, är mycket olika. De flesta splitsningsrepressorer är heterogena nukleära ribonukleoproteiner (hnRNP) såsom hnRNPA1 och polypyrimidin-kanalbindningsproteinet (PTB) [5] [30] .
Splitsningsförstärkare binder splitsningsaktivatorproteiner, vilket ökar den effektiva sannolikheten för att ett splitsningsställe kommer att vara i närheten. Både introner (intronsplitsningsförstärkare, ISE) och exoner (exonsplitsningsförstärkare, ESE) kan också tjäna som deras värd. De flesta av proteinerna som binder till ISE och ESE tillhör proteinfamiljen SR (reglerar inte bara förloppet av alternativ splitsning, utan även många andra cellulära processer [32] ; det första av proteinerna i denna familj, identifierat som en skarvningsfaktor, upptäcktes 1991 [33] ). Dessa proteiner innehåller RNA-igenkänningsmotiv såväl som arginin- och serinrika domäner [ 5 ] [ 30 ] .
Sålunda verkar splitsningsfaktorer inbördes beroende, och resultatet av deras verkan beror också på miljön [31] . Närvaron av vissa cis -regulatoriska RNA-sekvenser kan både öka sannolikheten för att ett splitsningsställe kommer att vara i närheten och minska denna sannolikhet, beroende på sammanhanget. Till exempel påverkar vissa av dessa element skarvning endast om det finns andra väldefinierade element bredvid dem. Dessutom kan cis -regulatoriska element ha olika effekter när vissa proteiner uttrycks i cellen. Den adaptiva betydelsen av förstärkare och splitsningsljuddämpare bekräftas av studier som visar att mutationer i mänskliga gener som leder till bildandet av nya ljuddämpare eller förstörelse av gamla förstärkare är föremål för strikt urval [34] [35] .
Pre-mRNA för dsx genen från Drosophila D. melanogaster innehåller 6 exoner. Hos män inkluderar det mogna mRNA:t exon 1, 2, 3, 5, 6 och kodar för ett protein som fungerar som en transkriptionell regulator i utveckling av manlig typ. Hos honor inkluderar det mogna mRNA:t exon 1, 2, 3 och 4, med exon 4 som innehåller en polyadenyleringssignal, vid vilken mRNA:t skärs. Det resulterande proteinet fungerar som en transkriptionell regulator i utveckling av kvinnlig typ [36] .
I det beskrivna exemplet sker alternativ skarvning av exon-hoppningstypen. Intronen uppströms om exon 4 innehåller en polypyrimidinkanal som inte helt uppfyller konsensussplitsningssekvensen; därför binder U2AF-proteiner till det dåligt i frånvaro av splitsningsaktivatorer. Av denna anledning används inte detta 3'-skarvningsacceptorställe hos män. Hos honor finns dock skarvningsaktivatorn Transformer (Tra). Detta protein binder till SR-proteinet Tra2 (som produceras hos båda könen och binder till ESE i exon 4) och bildar tillsammans med ett annat SR-protein, dsxRE, ett komplex som underlättar bindningen av U2AF-proteiner till den svaga pyrimidinkanalen. U2 rekryteras till motsvarande grenpunkt, vilket resulterar i inkorporering av exon 4 i det mogna mRNA [36] [37] .
Alternativa acceptorplatser: Drosophila TransformerPre-mRNA från D. melanogaster Transformer (Tra) genen genomgår alternativ splitsning enligt modellen för alternativa acceptorställen. Tra-genen kodar för ett protein som endast uttrycks hos kvinnor. Det primära transkriptet av denna gen innehåller ett intron med två möjliga acceptorställen. Hos män är uppströmsacceptorstället involverat, på grund av vilket mRNA inkluderar en utökad version av exon 2 innehållande ett för tidigt stoppkodon; därför bildas ett trunkerat inaktivt protein hos män. Kvinnor, å andra sidan, producerar ett komplett protein som spelar en nyckelroll i könsbestämning och är känt som Sex lethal (Sxl). Sxl-proteinet är en splitsningsrepressor och förhindrar, genom att binda till ISS i Tra RNA-transkriptet nära uppströms acceptorstället, bindningen av U2AF-proteinet till polypyrimidinområdet; som ett resultat binder spliceosomen till acceptorstället nedströms, vilket resulterar i avlägsnandet av det prematura stoppkodonet. Det resulterande mRNA:t kodar för Tra-proteinet, som i sig fungerar som en regulator av alternativ splitsning av andra könsrelaterade gener (se exemplet med dsx -genen ovan ) [3] .
Alternativ splitsning av Fas-receptornAlternativ splitsning resulterar i syntesen av flera isoformer av Fas -receptorn . Hos människor bildas två normala isoformer av denna receptor genom exonhoppning. Ett mRNA som innehåller 6 exoner kodar för en membranbunden form av Fas-receptorn som stimulerar apoptos . Ökad bildning av Fas-receptorn i celler som ständigt exponeras för solljus och frånvaron av denna receptor i hudcancerceller indikerar att mekanismen som övervägs spelar en viktig roll i elimineringen av celler som har börjat omvandlas till cancer [38] . När exon 6 hoppas över bildas en vattenlöslig isoform av Fas-proteinet, som inte kan stimulera apoptos. Valet mellan exoninsättning eller överhoppning beror på verkan av två antagonistproteiner: TIA-1 och PTB.
Donatorstället som ligger vid 5'-änden av intronet efter exon 6 i pre-mRNA:t är dåligt anpassat till konsensussplitsningssekvensen och binder inte alltid till snRNP U1 [5] . Om U1-bindning inte inträffar hoppas exon 6 över (bild a i figuren till höger). Bindning av TIA-1-proteinet till intronsplitsningsförstärkaren stabiliserar U1-bindning. Donatorstället som bildas vid 5'-änden av intronet hjälper splitsningsfaktorn U2AF att binda till 3'-splitsningsstället beläget uppströms exonet, även om mekanismen för detta ännu inte är klarlagd (bild b i figuren till höger) [39 ] . Exon 6 innehåller en pyrimidinrik splitsningsljuddämpare ( ure6 ) som PTB kan binda till. Om PTB-bindning inträffar, främjar inte donatorstället vid 5'-änden av intronen U2AF-bindning, och exonet hoppas över (bild c i figuren till höger).
Mekanismen som beskrivs ovan är ett exempel på exondefinition under skarvning. Splitsosomen sätts samman vid området för intronen och snRNP:n viker RNA:t så att 5'- och 3'-ändarna av intronen förenas. I det ovan beskrivna fallet samverkar emellertid exonändarna också. I det här fallet krävs interaktioner som definierar exongränser för bindning av kärnsplitsningsfaktorer före montering av spliceosomen vid gränserna för flankerande introner [39] .
Repressor-aktivatorkonkurrens: exon 2 av HIV-1 tat -genenHIV , ett retrovirus som orsakar AIDS , bildar ett enda pre-mRNA, från vilket mer än 40 olika mRNA sedan bildas genom alternativ splitsning [40] . Balansen mellan olika splitsade transkript säkerställer bildandet av mRNA som kodar för alla proteiner som krävs för virusreplikation [41] . En av de annorlunda splitsade transkripten innehåller transkriptet av tat genen , där exon 2 är en kassett, det vill säga den kan antingen inkluderas i det slutliga transkriptet eller inte. Inkluderingen av denna exon regleras av splitsningsrepressorn hnRNP A1 och SR-proteinet SC35. I exon 2 överlappar ljuddämparsekvensen (ESS) och förstärkarsekvensen (ESE). Om A1-repressorn binder till ESS utlöser den samverkande bindning av A1- molekyler , vilket stänger donatorstället i 5'-änden uppströms om exon 2 och förhindrar U2AF35 från att binda till polypyrimidinområdet. Om SC35 binder till ESE, förhindrar det A1 från att binda och 5'-donatorstället förblir tillgängligt för spliceosomen. Konkurrens mellan repressorn och aktivatorn leder till bildandet av RNA, som innehåller eller inte innehåller exon 2 [40] .
Alternativ splitsning är ett av undantagen från regeln att en gen motsvarar ett protein (hypotes "en gen - ett enzym ") [42] . Det skulle vara mer korrekt att säga: "en gen - många polypeptider ". Extern information behövs för att bestämma vilken polypeptid som ska bildas från ett givet mRNA. Eftersom regleringsmetoderna är nedärvda öppnar detta upp ett nytt sätt för mutationer att förändra genuttrycket [9] .
För eukaryoter antas alternativ splitsning vara ett mycket viktigt steg mot att öka effektiviteten av genuttryck, eftersom det gör det möjligt att lagra information mer ekonomiskt. En gen kan ge upphov till flera proteiner snarare än ett, så samma proteomdiversitet kan erhållas från ett betydligt mindre genom [3] . Det ger också evolutionär flexibilitet. En enda punktmutation kan leda till inkludering eller uteslutning av en exon från transkriptet, på grund av vilken en ny proteinisoform kan erhållas utan att förlora sin huvudform [3] . I själva verket har oordnade regioner hittats som innehåller många icke-konstitutiva exoner, så proteinisoformer kan utföra nya funktioner genom att ändra de funktionella modulerna på dessa platser [43] [44] [45] . Jämförande uppskattningar visar att uppkomsten av alternativ splitsning under evolutionens gång föregick uppkomsten av multicellularitet; tyder på att alternativ splitsning var ett av de medel som säkerställde uppkomsten av flercelliga organismer [46] .
Forskning av Human Genome Project och andra genomsekvenseringsprojekt har visat att det mänskliga genomet bara är 30 % större än det hos nematoden Caenorhabditis elegans och bara dubbelt så mycket som hos fruktflugan Drosophila melanogaster . Dessa data tyder på att komplexiteten hos människor och ryggradsdjur i allmänhet kan bero på den ökade användningen av alternativ splitsning jämfört med ryggradslösa djur [47] [48] . Ytterligare studier av genomiska sekvenser för människa, mus, råtta , bovin , D. melanogaster , C. elegans och Arabidopsis thaliana visade att det inte finns någon signifikant skillnad i användningen av alternativ splitsning mellan människor och andra eukaryoter [49] . Det finns emellertid bevis för att de erhållna uppgifterna är en artefakt associerad med ojämn inkludering i den jämförande analysen av komplementära DNA-sekvenser tagna från olika organismer. När man jämförde frekvensen av att använda alternativ splitsning för slumpmässiga prover av gener erhållna från jämförda organismer, visade det sig att alternativ splitsning fortfarande är vanligare hos ryggradsdjur än hos ryggradslösa djur [50] .
Förändringar i RNA-bearbetningsapparaten kan leda till splitsningsstörningar i många transkript, och enstaka nukleotidsubstitutioner i splitsningsställen eller cis- regulatoriska splitsningsställen leder till skillnader i splitsning av samma gen, som vid splitsning av ett muterat gentranskript. I en studie från 2005 visades det att över 60 % av mutationer som leder till utveckling av sjukdomar inte påverkar själva kodningssekvensen, utan splitsning [51] . Det har också visat sig att ungefär en tredjedel av de ärftliga sjukdomarna är förknippade med skarvningsrubbningar [25] .
Onormalt splitsade mRNA finns i en betydande andel av cancercellerna [7] [8] [10] . Analys av RNA-Seq och proteomer visade uttalade skillnader i uttrycket av splitsningsisoformer av de proteiner som är involverade i signalvägar associerade med cancerutveckling [52] . Det är inte känt om skarvningsstörningar påverkar utvecklingen av cancer direkt, eller om de är resultatet av ett sammanbrott i cellulära processer på grund av övergången till cancertillväxt. Det har noterats att i vissa typer av cancer, såsom tjocktarmscancer eller prostatacancer , varierade antalet skarvningsfel avsevärt hos olika patienter; detta fenomen har kallats transkriptomisk instabilitet [53] [54] .
Dessutom har transkriptominstabilitet visats vara associerad med minskat uttryck av splitsningsfaktorgener. Faktum är att i allmänhet används alternativ splitsning mindre i cancerceller än i normala celler, och splitsningsmönster skiljer sig också. I cancerceller inträffar således intronretention oftare än i normala celler, medan exon-hoppning inträffar mer sällan. Funktioner av splitsning i cancerceller kan vara associerade med en hög frekvens av somatiska mutationer i generna av splitsningsfaktorer, och vissa funktioner kan bero på förändringar i fosforyleringen av trans -regulatoriska splitsningsfaktorer [55] [9] . Vissa egenskaper hos skarvning kan vara förknippade med en förändring i det relativa antalet av dess faktorer; till exempel, ökade nivåer av splitsningsfaktor SF2/ASF [ [56] observeras i bröstcancerceller . En studie visade att en relativt liten andel (383 av 26 000) av alternativa splitsningsvarianter var betydligt vanligare i cancerceller än i normala celler; det följer att det finns ett begränsat antal gener vars avvikande splitsning leder till tumörutveckling [57] . Man tror dock att den skadliga effekten av försämrad skarvning begränsas av en speciell cellulär post-transkriptionell kontrollmekanism, nonsens-medierat förfall [58] .
Ett exempel på en gen vars specifika splitsningsvariant är associerad med utvecklingen av cancer hos människor är en av DNMT - generna . De tre DNMT-generna kodar för enzymer som lägger till metylgrupper till DNA, och modifiering av dessa gener har ofta reglerande effekter. Flera onormalt splitsade mRNA från DNMT3B -genen har hittats i tumörer och cancercellinjer [ . Uttryck av två av dessa mRNA orsakade förändringar i DNA- metylering i dessa celler. Celler med ett onormalt mRNA växte dubbelt så snabbt som kontrollceller, så de upptäckta mRNA är associerade med cancerutveckling [9] .
Ett annat exempel är proto-onkogenen Ron ( MST1R ). En viktig egenskap hos cancerceller är deras förmåga att migrera ( metastasera ) till normala vävnader och störa deras arbete. Bildandet av onormalt skarvat Ron-mRNA har associerats med ökade nivåer av SF2/ASF i bröstcancerceller. Den onormala Ron-isoformen översatt från detta mRNA ökade cellmotiliteten [56] .
Överuttryck av en trunkerad version av FOSB proteinet , ΔFosB, i en specifik population av neuroner i nucleus accumbens ligger till grund för uppkomsten och underhållet av drogberoende och naturlig belöning [ 59] [ 60] [61] [62] .
Nyligen genomförda studier pekar på rollen av kromatinstruktur och histonmodifieringar i regleringen av alternativ splitsning. Därför kan epigenetiska faktorer påverka inte bara genuttryck, utan också deras splitsning [63] .
Genomomfattande analys av alternativ splitsning är en utmanande uppgift. Vanligtvis hittas alternativt splitsade transkript genom att jämföra uttryckta sekvenstaggar ( Engelska uttryckta sekvenstaggar, EST ). De flesta EST-bibliotek är sammansatta från ett mycket begränsat antal vävnader, så vävnadsspecifika transkript har inte tidigare övervägts. Det har dock dykt upp metoder med hög genomströmning för att studera splitsning, såsom DNA-mikroarrayer och djupsekvensering ( eng. djupsekvensering ). Dessa metoder kan användas för att söka efter polymorfismer och mutationer som finns i de splitsningselement som påverkar proteinbindning, eller i deras omedelbara närhet. Genom att kombinera dessa metoder med splitsningstekniker såsom in vitro reportergenanalys , är det möjligt att studera effekten av polymorfismer och mutationer på pre-mRNA splitsning [25] [30] [64] .
Mikroarrayanalys använder DNA-fragment som är enstaka exoner (som Affymetrix microarray ) eller gränser mellan exoner. Det märkta cDNA:t från vävnaden av intresse läggs sedan till mikroarrayen. Detta prob-cDNA binder komplementärt till DNA-fragment som redan finns på mikroarrayen. Tack vare denna metod kan närvaron av vissa alternativt splitsade mRNA detekteras [65] .
CLIP-metoden ( engelska Cross-linking and immunoprecipitation - the formation of cross-links and immunoprecipitation ) använder UV-strålning för att bilda tvärbindningar mellan proteiner och RNA som genomgår splitsning. De transverkande regulatoriska splitsningsproteinerna fälls sedan ut med specifika antikroppar . När RNA associerat med proteinet isoleras och klonas, bestäms sekvensen av RNA som associeras med det regulatoriska proteinet [6] . Användningen av reportergener gör det möjligt att identifiera splitsningsproteiner involverade i specifika fall av alternativ splitsning: beroende på hur splitsningen ägde rum kommer reportergenen att ge upphov till två olika fluorescerande proteiner . Denna metod användes för att isolera mutanter med nedsatt splitsning och för att identifiera regulatoriska splitsningsproteiner inaktiverade i dessa mutanter [6] .
| Post-transkriptionella modifikationer | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Kärn |
| ||||||||
| Cytosolisk |
| ||||||||