Bioortogonala reaktioner är kemiska reaktioner som kan inträffa inom levande system utan att störa naturliga biokemiska processer [1] [2] [3] . Funktionella grupper involverade i bioortogonala reaktioner, som regel, finns inte i biomolekyler, reagerar snabbt och selektivt med varandra under levande cellförhållanden och är inerta med avseende på andra föreningar som finns i kroppen. Termen föreslogs av Caroline Bertozzi 2003 [4] . Namnet på reaktionerna är baserat på den bildliga betydelsen av ordet " ortogonal ", det vill säga oberoende av något, och betecknar det ömsesidiga oberoendet av flödet av artificiella och naturliga processer.
Trots det faktum att ett stort antal kemiska reaktioner har upptäckts, studerats och beskrivits inom området organisk kemi , kan praktiskt taget ingen av dem utföras i en cell eller organism för att endast påverka den förening som är av intresse för forskaren ( protein , DNA , metabolit , etc.). Detta beror på att biomolekyler innehåller ett stort antal funktionella grupper som är mycket lika i reaktivitet (främst nukleofila ), och reaktionen i vilken föreningen som studeras kommer in kommer oundvikligen att påverka andra molekyler som innehåller liknande funktionella grupper, som kanske inte bara inte uppfyller målen för studera, men också störa cellens naturliga arbete, vilket gör det omöjligt att studera det [5] . Samtidigt är att utföra kemiska reaktioner inuti cellen ett användbart forskningsverktyg, eftersom det låter dig märka de studerade biomolekylerna med fluorescerande , affinitets- och masspektrometriska etiketter, vilket senare kommer att tillåta att dessa biomolekyler kan observeras med lämpliga forskningsmetoder, till exempel genom att använda ett fluorescerande mikroskop . Bioortogonala reaktioner är utformade för att fylla denna lucka, eftersom de är helt främmande för cellen, förekommer mellan artificiellt införda funktionella grupper och har liten effekt på cellens funktion [3] .
Användningen av bioortogonal reaktion i praktiken utförs vanligtvis i två steg. Först modifieras föreningen som studeras med en bioortogonal funktionell grupp i cellen. Sedan införs en märkning med låg molekylvikt innehållande en komplementär funktionell grupp i systemet, och som ett resultat av en bioortogonal reaktion sker en selektiv modifiering (märkning) av denna förening [3] [5] . Därefter låter den införda etiketten dig övervaka det modifierade substratet.
Bioortogonala reaktioner har nu gjort det möjligt att studera olika biomolekyler , såsom glykaner , proteiner [6] och lipider [7] , i realtid i levande system i frånvaro av cytotoxicitet . Flera kemiska reaktioner har utvecklats som uppfyller kraven på bioortogonalitet, bland dem 1,3-dipolär cykloaddition azider till cyklooktyner (även kallad kopparfri klickreaktion ) [8] , nitroner till cyklooktyner [9] ] , bildning av oximer eller hydrazoner från karbonylföreningar [10] , reaktion av tetraziner med cyklooktener [11] , klickreaktion av isonitriler och kvadricyklanligering [ 13] .
Den första observationen av selektiv kovalent modifiering med användning av en kemisk reaktion under cellförhållanden dök upp i arbetet av R. Qian et al., som använde fluorescein med två arsinfunktionella grupper för att selektivt modifiera ett protein i vilket ett tetracysteinfragment , som praktiskt taget är frånvarande i däggdjursproteiner , introducerades tidigare [14] . Detta tillvägagångssätt gjorde det möjligt att införa en liten fluorescerande märkning i proteinet, medan standardmetoden för den tiden var att erhålla hybrider med grönt fluorescerande protein eller dess analoger [15] , som är mycket större och som ett resultat ibland stör proteinets normala funktion.
Detta tillvägagångssätt fick kemister att leta efter kemiska reaktioner och funktionella grupper som är helt främmande för naturliga föreningar, och biologer att uppfinna sätt att introducera bioortogonala funktioner i biomolekyler. Det första steget var insikten att biomolekyler huvudsakligen innehåller nukleofila grupper, medan elektrofila grupper är mycket mindre vanliga i dem. Till exempel förekommer inte ketoner och aldehyder i proteiner, samtidigt som de uppvisar reaktivitet mot hydrazid- och hydroxyamingrupper, som inte heller förekommer i biomolekyler. På grund av detta, i slutet av 1990-talet, blev modifiering av glykaner och proteiner genom metaboliskt införda ketoninnehållande sockerarter och aminosyror möjlig inom cellen. Ketoner och aldehyder fanns emellertid i metaboliter med låg molekylvikt (socker, pyruvat , pyridoxalfosfat , etc.), det vill säga de var inte helt bioortogonala [16] .
Därefter sökte kemister efter bioortogonala reaktioner mellan helt onaturliga funktionella grupper. Staudinger-reaktionen var den första kemiska reaktionen anpassad för att utföra modifieringar inuti cellen. Azidgruppen som går in i denna reaktion tillhör de mjuka elektrofilerna, som inte kan reagera med de hårda nukleofiler som är vanligast i naturen. Partnern för azid var fosfin, en mjuk nukleofil som föreslogs av G. Staudinger 1919 [17] . År 2000 modifierades Staudinger-reaktionen av C. Bertozzi och användes som bioortogonal Staudinger-ligering för märkning av ett brett spektrum av biomolekyler både i levande celler och hela organismer [18] .
Samtidigt började klickkemi utvecklas - ett kemiskt koncept som beskriver framställningen av bibliotek av organiska föreningar med hjälp av snabba och pålitliga reaktioner som gör att molekyler kan sättas ihop från små byggstenar [19] . Bland flera reaktioner som uppfyller detta koncept har den kopparkatalyserade azid-alkyncykloadditionen hittat den bredaste tillämpningen för in vitro -modifiering av biomolekyler [20] . Men på grund av kopparkatalysatorns toxicitet kunde en sådan reaktion inte användas i levande celler eller organismer. C. Bertozzis grupp skapade en icke-katalytisk variant av denna reaktion, känd som stress-facilitated azid-alkyne cycloaddition (SPAAC), som är en lovande bioortogonal reaktion [8] .
För närvarande fortsätter sökandet efter nya bioortogonala reaktioner för att kunna utföra parallell modifiering av substrat i samma biologiska system.
I det ideala fallet bör den bioortogonala reaktionen uppfylla följande särskilda villkor [3] [4] :
Denna reaktion utvecklades av C. Bertozzis grupp år 2000 på basis av den klassiska Staudinger-reaktionen mellan azider och triarylfosfiner [18] . Denna reaktion blev förfadern till området för bioortogonal kemi, eftersom grupperna som reagerar i det (azider, fosfiner) inte finns i biomolekyler, men nu används det inte lika brett. Staudinger ligering har använts för att modifiera biomolekyler i både levande celler och möss [4] .
I Staudinger-reaktionen fungerar azidgruppen som en mjuk elektrofil , som reagerar med mjuka nukleofiler som fosfiner . De flesta biologiska nukleofiler är däremot stela nukleofiler som inte reagerar med azider. Dessutom fortsätter Staudinger-ligeringen i ett vattenhaltigt medium med bildandet av en stabil produkt [18] .
Fosfiner saknas i naturliga biomolekyler [21] och återställer inte disulfidbindningar .
Med exemplet läkemedel ( azidotymidin ) har azider visat sig vara biokompatibla . Den lilla storleken på azidgruppen gör det lätt att introducera den i biomolekyler via metabola vägar [8] .
Grunden för Staudinger-reaktionen är den nukleofila attacken av fosfin på den terminala kväveatomen i azidgruppen för att bilda fosfazid 1 . Därefter omvandlas fosfazid 1 till iminofosforan 3 åtföljt av kvävefrisättning, varefter hydrolysen av iminofosforan sker med bildning av amin och fosfinoxid. För tillämpningar inom området för biokonjugation modifierades reaktionen genom att införa en estergrupp i ortopositionen av en av fosfinens arylsubstituenter. Som ett resultat av attacken av den resulterande iminofosforanen 3 på denna grupp, bildas en bicyklisk produkt 4 , vars hydrolys leder till bildandet av en stabil amidbindning mellan substratet och den införda markören. Det hastighetsbegränsande steget i reaktionen är attacken av azidgruppen av fosfinmolekylen [22] .
Den största nackdelen med denna reaktion är att fosfiner långsamt oxideras av syre i levande system. Dessutom metaboliseras de förmodligen av cytokrom P450 [4] . Ligering enligt Staudinger fortskrider ganska långsamt, enligt andra ordningens kinetik, med en hastighetskonstant på cirka 0,0020 M −1 s −1 [4] . Försök att påskynda den nukleofila attacken genom att införa elektrondonerande grupper i arylsubstituenter påskyndar reaktionen, men fosfinoxidationshastigheten ökar också.
Den långsamma reaktionshastigheten kräver en ökning av koncentrationen av fosfin som används, vilket ökar bakgrundssignalen som produceras av överskottsmarkören. Ansträngningar gjordes för att övervinna detta problem: fluorogena fosfiner baserade på fluorescein [23] och kumarin [24] syntetiserades , vars verkan är baserad på fluorescensuppbyggnaden först efter inkorporering i biomolekylen, vilket gjorde det möjligt att erhålla en större hopp i strålningsintensiteten till följd av reaktionen. För närvarande förblir reaktionens kinetik ett allvarligt hinder för dess utbredda användning.
Kopparfri azid-alkyncykloaddition är en bioortogonal reaktion utvecklad av C. Bertozzi som en aktiverad version av Huisgen-reaktionen . Till skillnad från kopparkatalyserad azid-alkyncykloaddition ( CuAAC , Cu-katalyserad azid-alkyncykloaddition) fortskrider denna variant av reaktionen i en högre hastighet på grund av avlägsnandet av vinkelspänningen i cyklooktynmolekylen under bildningen av additionsprodukten. Därför blev denna reaktion känd som stambefrämjad azid-alkyncykloaddition ( SPAC ). Denna modifiering gör det möjligt att undvika användningen av en giftig kopparkatalysator och använda en kopparfri reaktion i levande celler och organismer.
Den klassiska kopparkatalyserade azid-alkyncykloadditionen är en mycket snabb och effektiv biokonjugeringsreaktion , men den kan inte användas i levande celler på grund av Cu + -jonernas toxicitet . Toxiciteten tillskrivs bildningen av reaktiva syreämnen som genereras av kopparkatalysatorer.
Ligander har optimerats för att förhindra skadliga effekter på biomolekyler, men det har visat sig att olika ligandmiljöer i komplex också påverkar ämnesomsättningen, eftersom de introducerar oönskade förändringar i cellulära processer [25] .
Azidgruppen är bioortogonal, eftersom den är ganska liten (den har liten effekt på penetrationen av molekylen in i cellen), metaboliskt stabil och förekommer inte i naturliga biomolekyler. Även om azider inte är de mest reaktiva föreningarna i 1,3-dipolär addition, är de föredragna på grund av frånvaron av sidoreaktioner under modifieringsförhållandena [26] . Cyklooktynfragmentet är större, men det har den ortogonalitet och stabilitet som krävs för modifiering in vivo . Cyklooktiner är de minsta stabila cykliska alkynerna . Den beräknade vinkelspänningen i deras cykler är 19,9 kcal/mol [27] .
Reaktionen fortskrider som en standard 1,3-dipolär cykloaddition med ett matchat pericykliskt elektronskifte. Den ambivalenta naturen hos 1,3-dipolen gör det omöjligt att bestämma det elektrofila och nukleofila centrumet i aziden, så bilden av elektronövergångsriktningen är meningslös. Men beräkningar visar att den inre kväveatomen bär den största negativa laddningen [28] .
Den kopparlösa azid-alkyncykloadditionen har anpassats för att använda nitroner istället för azider . I detta fall bildas N -substituerade isoxazoliner som reaktionsprodukter . Reaktionshastigheten ökar i ett vattenhaltigt medium och följer andra ordningens kinetik med en konstant från 12 till 32 M – 1 s– 1 beroende på substituenterna i nitronen. Trots den höga reaktionshastigheten är dess nackdel svårigheten att introducera nitronen i biomolekylen genom metabolisk märkning. Reaktionen användes för modellpeptidmodifiering och proteinpegylering [ 9] .
Under 2009 utvecklades en dipolär cykloadditionsreaktion av nitriloxider till norbornen . I synnerhet har den använts för postsyntetisk modifiering av oligonukleotider . Norbornen valdes som dipolarofil på grund av balansen mellan stressfrämjad reaktivitet och stabilitet. Nackdelarna med denna reaktion är den höga elektrofiliciteten hos nitriloxid, vilket leder till sidoreaktioner, samt den låga reaktionshastigheten [29] .
Cykloadditionsreaktionen av oxanorbornadien med azider fortsätter med efterföljande eliminering av furan genom retro-Diels-Alder-reaktionen. Ringstammen och elektronutarmningen av oxanorbornadien ökar dess reaktivitet i det begränsande steget av cykloaddition. Furanklyvning sker snabbt med bildning av stabil 1,2,3-triazol [ 30] . Preliminära studier har visat användbarheten av denna reaktion vid modifiering av peptider , och den har också använts för att skapa avbildningsföreningar i SPECT [31] .
Cykloadditionen av s - tetraziner och ( E )-cyklooktener fortsätter som en Diels-Alder-reaktion , följt av en retro-Diels-Alder-reaktion med frisättning av kväve. Reaktionen fortskrider mycket snabbt med en andra ordningens hastighetskonstant på 2000 M – 1 s– 1 (9:1 i metanol - vattensystemet ), vilket gör det möjligt att modifiera biomolekyler i mycket låga koncentrationer.
Beräkningen visade att spänningsenergin i ( Z )-cyklooktener är 7,0 kcal/mol, vilket är mindre än i cyklooktan (12,4 kcal/mol), på grund av förlusten av två transannulära interaktioner. Tvärtom ökar ( E )-konfigurationen av dubbelbindningen ringspänningen kraftigt (17,9 kcal/mol), vilket har en positiv effekt på reaktionshastigheten [32] . Som dienofil används 3,6-diaryl- s - tetrazin, som innehåller substituenter för att undertrycka interaktion med vatten. Frigörandet av kväve i det andra steget gör reaktionen irreversibel [33] .
Vatten har visat sig påskynda reaktionen mellan tetraziner och cyklooktener. Norbornener användes också som dienofiler, men reaktionen gick mycket långsammare (1 M – 1 s – 1 i ett vattenhaltigt medium). Reaktionen av tetraziner med ( E )-cyklookten användes för att märka levande celler med en fluorescerande märkning [34] och för att kombinera polymerer [35] .
Klickreaktionen för isonitriler är en [4+1]-cykloaddition följt av en retro-Diels-Alder-reaktion för att frigöra N 2 . Av denna anledning är reaktionen irreversibel. Produkten är stabil om tertiär isonitril används. När det gäller primära och sekundära isonitriler bildas en imin som sedan snabbt hydrolyseras (visas i rött i diagrammet).
Isonitril är en bra bioortogonal grupp på grund av dess ringa storlek, stabilitet, icke-toxicitet och frånvaro från biologiska system. [4+1]-cykloadditionsreaktionen fortskrider dock långsamt med en andra ordningens hastighetskonstant på 10–2 M – 1 s– 1 .
Tetrazol kan genomgå en fotoinducerad cykloelimineringsreaktion med kvävefrisättning. I detta fall bildas en kortlivad 1,3- dipol , som går in i en 1,3-dipolär cykloaddition med alkener , vilket leder till pyrazolinaddukter [36] .
Fotoinduktion fortsätter med kortvarig exponering för ljus (våglängden beror på tetrazol). Exponeringstiden väljs för att minska skadorna som orsakas av ljus på celler. Reaktionen accelererar i ett vattenhaltigt medium och ger en enda regioisomer . Fördelarna med detta tillvägagångssätt ligger i möjligheten till rumslig och tidsmässig kontroll över reaktionen. Användningen av reaktionen förenklas också av det faktum att alkener eller tetrazoler kan införas i biomolekyler med enkla biologiska metoder. Dessutom har en fluorogen tetrazol skapats som gör det möjligt att övervaka graden av reaktion i tid [37] .
Under kvadricyklanligering går den ansträngda kvadricyklanen in i [2+2+2]-cykloaddition med π-system. Quadricyclane förekommer inte i inhemska biomolekyler, reagerar inte med dem (på grund av molekylens mättnad), har en relativt liten storlek och stark spänning (≈ 80 kcal/mol). Det är dock mycket stabilt vid rumstemperatur och i vattenmiljöer vid fysiologiskt pH. Det kan reagera selektivt med elektronbristande π-system, men inte med enkla alkener , alkyner eller cyklooktyner [13] .
Bis(ditiobensyl)nickel(II) valdes som det andra reagenset som ett resultat av screening för reaktivitet. För att förhindra fotoinducerad inversion till norbornadien tillsätts dietylditiokarbamat till reaktionen, vilket kelerar nickel i den resulterande produkten. Reaktionen fortskrider med en andra ordningens hastighetskonstant på 0,25 M −1 s −1 (i ett vattenhaltigt medium).
Med användning av denna reaktion, såväl som kopparfri azid-alkyncykloaddition och reaktionen av oximbildning , skapades en metod för samtidig märkning av tre substrat utan ömsesidig störning av dessa tre reaktioner [13] .
Flera bioortogonala reaktioner, främst Staudinger-ligationen och den kopparfria azid-alkyncykloadditionen, används ofta inom biokonjugering och kemisk biologi .
Cellulära proteinsyntessystem, såväl som enzymer, kan introducera icke-naturliga aminosyror i proteinstrukturer och misstar dem för naturliga. I synnerhet fann man att ersättningen av metionin i bakteriers näringsmedium med homopropargylglycin ( Hpg ) eller azidohomoalanin ( Aha ) gjorde det möjligt att integrera dessa syntetiska aminosyror i proteiner syntetiserade av cellen. Sådana proteiner innehöll bioortogonala funktionella grupper, azid eller alkyn, och införandet av biotin och fluorescerande färgämnen utrustade med en komplementär funktionell grupp (fosfin, cyklooktyn eller azid) i cellen gjorde det möjligt att selektivt märka och studera dessa proteiner. Dessutom har azidohomoalanin och homopropargylglycin använts samtidigt för att modifiera två olika typer av proteiner parallellt [38] .
Bioortogonal kemi har också funnit tillämpning vid aktivitetsprofilering av proteiner proteiner som har en affinitet för en viss ligand . För att göra detta märks liganden med en bioortogonal funktionell grupp och introduceras i cellen. Efter att bindningen av proteiner till liganden har skett, förstörs cellen och hela proteinet införs i reaktionen med någon märkning som innehåller en komplementär reaktiv grupp. I detta fall introduceras märkningen endast i liganden och gör det möjligt att särskilja och isolera endast de proteiner som är associerade med denna ligand [39] .
Glykaner kodas inte direkt genetiskt och har inte den specifika aktiviteten hos proteiner; därför är metoder för genetisk eller affinitetsmärkning inte tillämpliga på dem. Emellertid kan glykaner modifieras metaboliskt med modifierade syntetiska kolhydrater ( sialinsyra , N -acetylgalaktosamin, N -acetylglukosamin, etc.) som innehåller azidgrupper. Glykaner med inbäddade azidgrupper infördes i Staudinger-ligering med ett biotinreagens och studerades med flödescytometri [18] .