Cellcykelkontrollpunkter är kontrollmekanismerna i den eukaryota cellcykeln som säkerställer dess korrekta utveckling. Varje kontrollpunkt fungerar som en potentiell cellcykelavslutningspunkt under vilken cellförhållandena bedöms, med progression genom de olika faserna av cellcykeln som endast inträffar när gynnsamma förhållanden är uppfyllda. Det finns många kontrollpunkter i cellcykeln [1] , men de tre huvudsakliga är: G1-kontrollpunkten, även känd som start- eller gränskontrollpunkten eller huvudkontrollpunkten; kontrollpunkt G2/M ; och övergången från metafas till anafas, även känd som spindelkontrollpunkten [2] . Passage genom dessa kontrollpunkter bestäms till stor del av aktiveringen av cyklinberoende kinaser av regulatoriska proteinsubenheter som kallas cykliner , olika former av vilka produceras i varje skede av cellcykeln för att kontrollera specifika händelser som inträffar i den [3] [4] .
Alla levande organismer är produkter av upprepade cykler av celltillväxt och -delning [5] . Under denna process, känd som cellcykeln , duplicerar cellen sitt innehåll och delar sig sedan i två. Målet med cellcykeln är att duplicera varje organisms DNA exakt och sedan dela cellen och dess innehåll jämnt mellan de två resulterande cellerna. Hos eukaryoter består cellcykeln av fyra huvudstadier: G 1 , under vilka cellen är metaboliskt aktiv och kontinuerligt växande; S-fas , under vilken DNA-replikation sker; G2 , under vilken celltillväxt fortsätter och cellen syntetiserar olika proteiner som förberedelse för delning; och M-fasen ( mitos ), under vilken de duplicerade kromosomerna (kända som systerkromatider ) separeras i två dotterkärnor och cellen delar sig i två dotterceller, var och en med en fullständig kopia av DNA:t [6] . Jämfört med den eukaryota cellcykeln är den prokaryota cellcykeln (känd som binär fission ) relativt enkel och snabb: en kromosom replikerar från replikationsursprunget, ett nytt membran sätts ihop och cellväggen bildar en septum som delar cellen i två [7] .
Eftersom den eukaryota cellcykeln är en komplex process, har eukaryoter utvecklat ett nätverk av regulatoriska proteiner som kallas cellcykelkontrollsystemet , som spårar och bestämmer cellens framsteg genom cellcykeln [5] . Detta system fungerar som en timer eller klocka som ställer in en fast tid som cellen måste spendera i varje fas av cellcykeln, och samtidigt reagerar den också på information som tas emot från de processer den kontrollerar. Cellcykelkontrollpunkter spelar en viktig roll i kontrollsystemet genom att upptäcka defekter som uppstår under grundläggande processer som DNA-replikation eller kromosomsegregering , och orsakar att cellcykeln stannar som svar tills defekterna är reparerade [8] . Den huvudsakliga verkningsmekanismen för cellcykelkontrollpunkter är att reglera aktiviteten hos en familj av proteinkinaser som kallas cyklinberoende kinaser (CDK), som binder till olika klasser av regulatoriska proteiner som kallas cykliner, varvid specifika cyklin-CDK-komplex bildas och aktiveras i olika faser av cellcykeln. Dessa komplex aktiverar i sin tur olika nedströmsmål för att stimulera eller förhindra cellcykelprogression [9] .
G1-kontrollpunkten, även känd som restriktionspunkten i däggdjursceller och startpunkten i jäst, är den punkt där cellen deltar i cellcykeln. När en cell passerar genom G1, beroende på interna och externa förhållanden, kan den antingen fördröja G1, gå in i ett vilotillstånd som kallas G0 , eller passera gränspunkten [5] . DNA-skada är huvudtecknet på att en cell är "begränsad" och inte går in i cellcykeln. Beslutet att starta en ny omgång av celldelning sker när cellen aktiverar cyklin-CDK-beroende transkription, vilket främjar inträde i S-fas. Denna kontrollpunkt tillhandahåller en ytterligare process [10] .
Under tidig G1 finns det tre transkriptionsrepressorer kända som pocketproteiner som binder till E2F- transkriptionsfaktorerna . E2F-genfamiljen är en grupp av transkriptionsfaktorer som riktar sig mot många gener som är viktiga för cellcykelkontroll, inklusive cykliner , CDKs, kontrollpunktsregulatorer och DNA-reparationsproteiner. Felreglering av E2F-familjen finns ofta i cancerfall, vilket tyder på att E2F-familjen krävs för en snäv reglering av DNA-replikation och delning [10] . De tre fickproteinerna är retinoblastom (Rb), p107 och p130, som binder till E2F-transkriptionsfaktorerna för att förhindra progression bortom G1-kontrollpunkten.
E2F-genfamiljen innehåller några proteiner med aktiveringsmekanismer och några proteiner med repressionsmekanismer. P107 och p130 fungerar som corepressorer för E2F 4 och E2F 5 som undertrycker transkriptionen av G1-till-S-stimulerande faktorer. Ett tredje fickprotein, Rb, binder till och undertrycker E2F 1 , E2F 2 och E2F 3 , som är E2F-proteiner med aktiverande förmåga [10] .
Positiv feedback spelar en viktig roll för att reglera övergången från G1-fas till S-fas, särskilt med avseende på Rb-fosforylering av Cyclin/CDK-proteinkomplexet. Rb utan fosfat eller icke-fosforylerad Rb reglerar G0-cellcykelns utträde och differentiering. I början av G1-fasen signalerar tillväxtfaktorer och DNA-skador en ökning av nivån av cyklin D, som sedan binder till Cdk4 och Cdk6 för att bilda CyclinD:Cdk4/6-komplexet [11] . Detta komplex är känt för att inaktivera Rb genom fosforylering. Men detaljerna i Rb-fosforylering är ganska komplexa och specifika jämfört med tidigare kunskap om G1-kontrollpunkten. CyclinD:Cdk4/6 placerar endast ett Rb-fosfat eller monofosforylat på ett av fjorton tillgängliga och unika fosforyleringsställen. Var och en av de fjorton specifika monofosforylerade isoformerna binder olika till medlemmar av E2F-familjen, vilket sannolikt ökar mångfalden av cellulära processer hos däggdjur [11] .
E2F 4 och E2F 5 är beroende av p107 och p130 för att upprätthålla sin nukleära lokalisering. Men cyklin D:Cdk 4/6 fosforylerar också p107 och p130, en process som frisätter deras bindning till E2F 4 och 5 (som sedan flyr in i cytoplasman) och tillåter E2F 1-3 att binda till DNA och initiera transkription. cyklin E [10] . Rb-proteiner behåller sitt monofosforylerade tillstånd under den tidiga G1-fasen, medan cyklin E ackumuleras och binder till Cdk2.
CyclinE:Cdk2 spelar en ytterligare viktig fosforyleringsroll i G1-till-S-övergången. I synnerhet främjar CyclinE:Cdk2 en positiv återkopplingsslinga som skapar en allt-eller-inget-växel. I många nätverk av genetisk kontroll säkerställer positiv feedback att cellerna inte glider mellan faserna av cellcykeln [12] . Cyklin E:Cdk2 fortsätter att fosforylera Rb vid alla dess fosforyleringsställen, även kallad "hyperfosforylering", vilket säkerställer fullständig inaktivering av Rb. Hyperfosforylering av Rb anses vara en sen G1-restriktionspunkt, varefter cellen inte kan återvända tillbaka i cellcykeln. Vid denna tidpunkt binder E2F 1-3-proteinerna till DNA och transkriberar cyklin A och Cdc 6 [11] .
Cyklinberoende kinas 1B-hämmare (CDKN1B), även känd som p27, binder till och förhindrar aktivering av CyclinE:Cdk2 genom hämning. Men eftersom cyklin A ackumuleras och binder till Cdk2, bildar de ett komplex och hämmar p27. Det cyklinberoende kinaset i G1-fasen arbetar tillsammans med det cyklinberoende kinaset i S-fasen för att rikta p27 för nedbrytning. Detta ger i sin tur full aktivering av Cyclin A:Cdk2, ett komplex som fosforylerar E2F 1-3, vilket initierar deras dissociation från promotor-DNA-regioner. Detta gör att E2F 6-8 kan binda till DNA och hämma transkription [10] . Den negativa återkopplingsslingan som används för att framgångsrikt hämma p27-hämmaren är en annan viktig process som används av celler för att säkerställa enkelriktad rörelse och ingen återgång i cellcykeln.
När DNA-skada inträffar, eller när en cell uppvisar några defekter som gör att den försenar eller stoppar cellcykeln vid G1, sker arresteringen genom flera mekanismer. Det snabba svaret involverar fosforyleringshändelser som utlöses av antingen ATM ( muterad ataxi telangiectasia ) eller ATR (muterad ataxi telangiectasia och Rad3 ) kinas, som fungerar som sensorer, beroende på typen av skada. Dessa kinaser fosforylerar och aktiverar effektorkinaserna Chk2 respektive Chk1, som i sin tur fosforylerar Cdc25A-fosfatas och markerar det för ubiquitination och nedbrytning. Eftersom Cdc25A aktiverar det tidigare nämnda cyklin E-CDK2-komplexet genom att ta bort hämmande fosfater från CDK2, i frånvaro av Cdc25A, förblir cyklin E-CDK2 inaktivt och cellen förblir i G1.
För att upprätthålla arrestering initieras ett annat svar genom vilket Chk2 eller Chk1 fosforylerar p53, en tumörsuppressor, och detta stabiliserar p53 genom att förhindra det från att binda till Mdm2, ett ubiquitinligas som hämmar p53, vilket leder till att det brytas ned. Stabil p53 fungerar sedan som en transkriptionell aktivator av flera målgener, inklusive p21, en hämmare av det G1-till-S-stimulerande komplexet, cyklin E-CDK2. Dessutom är en annan mekanism för p21-aktivering ackumuleringen av p16 som svar på DNA-skada. p16 bryter ner cyklin D-CDK4-komplexen och orsakar därigenom frisättning av p21 från komplexen, vilket leder till defosforylering och aktivering av Rb, vilket gör att Rb kan binda och hämma E2F 1-3, och därigenom förhindra cellen från att gå in i S-fasen [ 13] . Nyligen har vissa aspekter av denna modell ifrågasatts [14] .
Efter DNA-replikation i S-fas går cellen igenom en tillväxtfas som kallas G2. Under denna tid produceras de nödvändiga mitotiska proteinerna och cellen utsätts återigen för regleringsmekanismer för att säkerställa rätt status för inträde i den proliferativa mitotiska (M) fasen. Denna övergång från G2 till M involverar flera mekanistiska kontrollpunkter med en gemensam förenande faktor för cyklin-Cdk-aktivitet.
Även om variationer i de erforderliga cyklin-Cdk-komplexen existerar mellan organismer, kvarstår behovet av kinasaktivitet och är vanligtvis fokuserat på en enda parning. I fissionsjäst finns det tre olika former av mitotiskt cyklin och i spirande jäst finns det sex, men det huvudsakliga cyklin som används är cyklin B [15] . Cyclin B kommer att fungera som referens för diskussion av G2/M-kontrollpunktsövergången.
I likhet med S-fasen upplever G2 en DNA-skadekontroll. Cellen undersöks på nytt för DNA-skada eller ofullständig replikation, och ATR- och ATM-kinaser rekryteras till skadan. Aktiveringen av Chk1 och Chk2 sker också, liksom aktiveringen av p53, för att orsaka cellcykelstopp och stoppa övergången till mitos. En ytterligare S-faskomponent, prereplikationskomplexet, måste inaktiveras genom fosforylering av cyklin B-Cdk1 [16] .
Eftersom dessa tidigare kontrollpunkter utvärderas, tjänar G2-proteinackumulering till att aktivera cyklin B-Cdk1-aktivitet genom flera mekanismer. cyklin A-Cdk2 aktiverar Cdc25, cyklin B-Cdk1-aktivatorn, som sedan inaktiverar cyklin B-Cdk1-hämmaren, Wee1. Detta resulterar i en positiv återkopplingsslinga som signifikant ökar cyklin B-uttryck och Cdk1-aktivering. När cellen passerar genom G2 och når G2/M-övergången, fosforylerar Plk1-kinaset Wee1, som riktar sig till Wee1 för nedbrytning via SCF ubiquitinligaskomplexet [17] . En ytterligare funktion hos Plk1 är att aktivera Cdc25 via fosforylering. Den kombinerade effekten av Wee1-nedbrytning och Cdc25-aktivering är nettoavlägsnandet av hämmande cdc2-fosforylering som aktiverar cdc2. Plk1 aktiveras under G2/M-övergången av Aurora A och Bora, som ackumuleras under G2 och bildar ett aktiveringskomplex. Plk1-Cdc2-cdc25-komplexet initierar sedan en positiv återkopplingsslinga som tjänar till att ytterligare aktivera Cdc2, och i kombination med en ökning av cyklin B-nivåer under G2, aktiverar de resulterande cdc2-cyklin B-komplexen sedan nedströms mål som främjar inträde i mitos [ 18] . Den resulterande Cdk1-aktiviteten aktiverar också uttrycket av Mem1-Fkh, G2/M-övergångsgenen [19] . En snabb explosion av cyklin B-Cdk1-aktivitet är nödvändig eftersom initieringen av M-fasen är en allt-eller-inget-händelse associerad med hysteres. Hysteresen av Cdk1-aktivitet via cyklin B leder till inträde i M-fasen, vilket sätter ett lägsta tröskelvärde för koncentrationen av cyklin B. Det existerar över det minimum som krävs för att fortsätta M-fasen efter inträdet, vilket verkar för att skydda allt-eller-inget-händelsen. Denna ingångskoncentration ökas ytterligare i fallet med ofullständig DNA-replikation, vilket lägger till ytterligare en regleringsmekanism vid G2/M-övergångspunkten [20] . Närvaron av hysteres gör det möjligt att starkt kontrollera inträdet i M-fasen beroende på aktiviteten av cyklin B-Cdk1.
Mekanismerna genom vilka mitotiskt inträde förhindras som svar på DNA-skada liknar dem vid G1/S-kontrollpunkten. DNA-skada utlöser aktivering av den tidigare nämnda ATM/ATR-vägen, där ATM/ATR fosforylerar och aktiverar Chk1/Chk2-kontrollpunktkinaserna. Chk1/2 fosforylerar cdc25, som inte bara hämmas utan även sekvestreras i cytoplasman av proteinerna 14-3-3. 14-3-3 aktiverar p53, som, som tidigare nämnts, aktiveras av Chk1 och ATM/ATR. p53 transaktiverar också p21, och både p21 och 14-3-3 hämmar i sin tur cyklin B-cdc2-komplex genom fosforylering och cytoplasmatisk sekvestrering av cdc2. Dessutom resulterar inaktivering av cdc25 i dess oförmåga att defosforylera och aktivera cdc2 [21] [22] . Slutligen är en annan skadesvarsmekanism nedreglering av Plk1 av ATM/ATR, vilket i sin tur leder till stabilisering av Wee1 och Myt1, som sedan kan fosforylera och hämma cdc2, och därigenom hålla cellen i G2 tills skadan är reparerad. korrigerad [23] .
I slutet av G2 går cellen in i mitos, där kärnan delar sig. Övergången från G2 till M är dramatisk; en allt-eller-inget-effekt uppstår, och övergången är irreversibel. Detta är fördelaktigt för cellen eftersom inträde i mitos är ett kritiskt steg i cellens livscykel. Om det inte är helt fixat kommer cellen att ha många problem med partiell delning, vilket så småningom sannolikt kommer att leda till celldöd.
I grodoocyter induceras en signalkaskad när progesteron binder till en membranbunden receptor. Mos aktiveras nedströms. Mos fosforylerar sedan MEK1, som fosforylerar MAPK. MAPK har två roller: det aktiverar cyklin B-Cdk1-komplexet för att initiera inträde i mitos, och det aktiverar Mos. Aktivering av Mos resulterar i en positiv återkopplingsslinga och fungerar därför som en "vippbrytare", vilket skapar en allt-eller-inget ingång till mitos.
Denna återkopplingsslinga upptäcktes först när MAPK-P (fosforylerad MAPK) koncentrationer visades öka som svar på ökade progesteronnivåer [24] . På individuell cellnivå hade varje cell antingen helt fosforylerad MAPK eller fosforylerade inte MAPK, vilket tyder på att den fungerar som en switchliknande mekanism i varje cell. Dessutom har blockering av Mos-proteinsyntes visat sig göra MAPK-P-svar mer graderade, vilket indikerar att Mos-proteinsyntes krävs för allt-eller-inget-mönstret för MAPK-aktivering [25] .
Denna process kan förstås med hjälp av bistabilitet. Med hjälp av grafen som visas till höger ändras hastigheten för Mos-syntesen när mer progesteron tillsätts. Varje kurva har stabila fixpunkter och instabila fixpunkter. Vid instabila fixpunkter kommer systemet att röra sig mot någon av de stabila fixpunkterna. Således kan systemet vara antingen i "på"-tillståndet eller i "av"-tillståndet, men inte i ett mellanliggande tillstånd. När progesteronnivåerna är tillräckligt höga skiftar Mos-kurvan högre och korsar så småningom nedbrytningslinjen vid endast en punkt, så det finns bara ett stabilt "på" tillstånd, vilket indikerar inträde i mitos.
Den irreversibilitet som vi observerar vid övergången till mitos härrör från en tillräckligt hög nivå av progesteron i cellen. Vid tillräckligt höga nivåer av progesteron är systemet monostabilt som ett resultat av positiv feedback mellan Mapk och Mos. Den punkt där systemet växlar från bistabilt till monostabilt kallas sadelnodbifurkationen.
Så vi kan förstå det irreversibla allt-eller-inget-svaret av mitotisk övergång med hjälp av en matematisk modell av molekylära regulatorer som ett bistabilt system som beror på förekomsten av positiv feedback. "Från-tillståndet" förstörs av tillräckligt höga nivåer av progesteron, och när cellen väl går utöver det avstängda tillståndet, fastnar den i på-tillståndet.
Baserat på denna bistabila modell kan vi förstå att den mitotiska övergången beror på hysteres. Hysteres definieras som ett systems tillstånds beroende av dess historia. Nowak-Tyson-modellen är en matematisk modell av cellcykelutveckling som förutsäger att irreversibla övergångar som går in i och ut ur mitos drivs av hysteres. Modellen har tre huvudförutsägelser som måste vara sanna för cykliska oocytextrakt vars cellcykelprogression beror på hysteres [26] :
Sha et al utförde experiment med Xenopus laevis äggextrakt 2003 för att visa denna hysteretiska natur [27] . Med hjälp av cykliska extrakt fann de att aktiveringströskeln för Δ cyklin B är 32 till 42 nM, medan inaktiveringströskeln är 16 till 24 nM Δ cyklin B. Således bekräftade dessa experiment bistabiliteten av detta system och vikten av hysteres i detta cell. loop övergång. Vid mellanliggande koncentrationer av cyklin B är antingen interfas eller mitotiskt tillstånd av cellen möjligt.
Eftersom inträde i mitos är ett stort och kostsamt åtagande för en cell, är det logiskt att system bör finnas på plats för att förhindra för tidigt inträde i detta stadium. Fel i tidigare steg, såsom närvaron av oreplikerade DNA-regioner, har visat sig blockera progression i cellcykeln [28] . Nowak-Tyson-modellen förutspår att detta beror på en ökning av nivån av cyklin B som krävs för inträde i mitos [26] .
Sha et al undersökte om detta var sant för Xenopus äggextrakt . De använde afidikolin (APH) för att hämma DNA-polymeras och förhindra DNA-replikation. Interfasbehandling med cyklin B ökade aktiveringströskeln till 80-100 nM, som förutspåtts av Nowak-Tyson-modellen [27] . Således bekräftar dessa experiment att stressen av oreplikerat DNA i cellen påverkar hysteresloopen och leder till en mycket högre tröskel för cyklin B att gå in i mitos.
Den mitotiska spindelkontrollpunkten inträffar vid metafaspunkten , när alla kromosomer måste/bör vara inriktade på den mitotiska plattan och vara under bipolär spänning. Spänningen som skapas av denna bipolära anknytning är vad som känns, vilket initierar inträde i anafas. För att göra detta säkerställer en sensorisk mekanism att det anafasstimulerande komplexet (APC/C) inte längre hämmas och nu är fritt att bryta ned cyklin B som innehåller D-boxen (destruktionsblocket) och att klyva securin [29] . Det senare är ett protein vars funktion är att hämma separas , som i sin tur klyver kohesiner , proteinkompositen som ansvarar för systerkromatidsammanhållningen [30] . När detta hämmande protein bryts ned genom ubiquitination och efterföljande proteolys, inducerar separase systerkromatidseparation [31] . Efter att cellen har delats upp i två dotterceller går den in i G1.
DNA-reparationsprocesser och cellcykelkontrollpunkter är nära besläktade med cancer genom deras funktioner som reglerar genomets stabilitet respektive cellprogression. De exakta molekylära mekanismerna som länkar dysfunktioner i dessa vägar till specifika cancerformer är inte väl förstått i de flesta fall [32] . Förlust av ATM har visat sig föregå utvecklingen av lymfom, förmodligen på grund av överdriven homolog rekombination som leder till hög genomisk instabilitet [33] . Störning av Chk1 hos möss resulterade i betydande dysreglering av cellcykelkontrollpunkter, ackumulering av DNA-skador och en ökad förekomst av tumörbildning [34] . Kanske mest känt, enkel BRCA1 eller BRCA2 mutant arv disponerar kvinnor för bröst- och äggstockscancer [35] . Det är känt att BRCA1 krävs för S- och G2/M-övergångar och är involverat i det cellulära svaret på DNA-skada. BRCA2 tros vara involverat i homolog rekombination och S-fas kontrollpunktsreglering, och bristfälliga mutationer i BRCA2 är nära förknippade med tumörbildning [36] .
| cellcykeln | |||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Faser |
| ||||||||||
| Regulatorer |
| ||||||||||