Ett antal biokemiska växlar styr övergångar mellan och inom olika faser av cellcykeln . Cellcykeln är en serie av komplexa, ordnade, sekventiella händelser som styr uppdelningen av en cell i två celler och inkluderar flera distinkta faser. Faserna inkluderar G1- och G2-faser, DNA-replikation eller S-fas, och själva processen av celldelning, mitos eller M-fas [1] . Under M-fasen separeras kromosomerna och cytokines uppstår.
Omkopplarna upprätthåller den ordnade utvecklingen av cellcykeln och fungerar som kontrollpunkter för att säkerställa att varje fas slutförs korrekt innan man går vidare till nästa fas [1] . Till exempel är Cdk, eller cyklinberoende kinas , en masterregulator av cellcykeln och tillåter cellen att övergå från G1 till S eller från G2 till M genom att tillsätta fosfat till proteinsubstrat. Sådana multikomponentswitchar (som involverar många sammankopplade proteiner) har visat sig generera avgörande, tillförlitliga (och potentiellt irreversibla) övergångar och utlösa stabila oscillationer [2] . Som ett resultat är de föremål för aktiv forskning som försöker förstå hur sådana komplexa egenskaper är relaterade till biologiska kontrollsystem [2] [3][4] .
Många biologiska kretsar producerar komplexa utgångar med hjälp av en eller flera återkopplingsslingor . I en sekvens av biokemiska händelser kommer återkoppling att hänvisa till ett nedströmselement i sekvensen (B i den intilliggande bilden) som påverkar någon uppströmskomponent (A i den intilliggande bilden) för att påverka sin egen produktion eller aktivering (output) i framtiden. Om detta element verkar för att öka sin egen produktion, deltar det i positiv feedback (blå pil). En positiv återkopplingsslinga är också känd som en självförstärkande slinga, och det är möjligt att dessa slingor kan ingå i en större slinga, eftersom detta är vanligt i regleringskretsar [1] .
Omvänt, om detta element leder till sin egen hämning genom högre element, är detta kanoniskt negativ feedback (röd trubbig pil). En negativ återkopplingsslinga är också känd som en balanseringsslinga och svängningar kan ofta ses där en fördröjd negativ återkopplingssignal används för att upprätthålla en homeostatisk balans i systemet [1] .
Återkopplingsslingor kan användas för förstärkning (positiv) eller självkorrigering (negativ). Rätt kombination av positiva och negativa återkopplingar kan generera överkänslighet och bistabilitet [5] [6] , vilket i sin tur kan generera kritiska övergångar och svängningar.
Positiva och negativa återkopplingsslingor fungerar inte alltid bra. I mekanismen för biokemiska switchar arbetar de tillsammans för att skapa ett flexibelt system. Till exempel, enligt Pfeuty & Kaneko (2009), för att övervinna bristen på biokemiska system, kan positiv feedback regulatoriska slingor interagera med negativa regulatoriska loopar för att underlätta återhämtning från stabila tillstånd [7] . Samexistensen av två stabila tillstånd kallas bistabilitet, vilket ofta är resultatet av positiv återkopplingskontroll.
Ett exempel som avslöjar interaktionen mellan flera negativa och positiva återkopplingsslingor är aktiveringen av cyklinberoende proteinkinaser, eller Cdks14. Positiva återkopplingsslingor spelar en roll genom att byta celler från låg till hög Cdk-aktivitet. Interaktionen mellan de två typerna av slingor manifesteras i mitos. Medan positiv återkoppling initierar mitos, främjar en negativ återkopplingsslinga inaktivering av cyklinberoende kinaser av det anafasstimulerande komplexet. Detta exempel visar tydligt de kombinerade effekterna av positiv och negativ feedback på cellcykelreglering.
Ett allt-eller-inget svar på en stimulans kallas överkänslighet . Med andra ord, en mycket liten förändring i stimulans orsakar en mycket stor förändring i respons, vilket skapar en sigmoidal dos-respons-kurva. Det överkänsliga svaret beskrivs av den allmänna ekvationen V = S n /(S n + Km ) , känd som Hill-ekvationen , när n, Hill-koefficienten, är större än 1. Lutningen på sigmoidkurvan beror på värdet av n. Värdet n = 1 ger ett hyperboliskt eller Michael-svar. Ultrakänslighet uppnås i olika system; ett anmärkningsvärt exempel är den kooperativa bindningen av enzymets hemoglobin till dess substrat. Eftersom överkänslig respons är nästan "digital" kan den användas för att öka responsen på en stimulans eller för att göra en plötslig abrupt övergång (mellan "av" och "på" tillstånd).
Ultrakänslighet spelar en viktig roll i regleringen av cellcykeln. Till exempel är Cdk1 och Wee1 regulatorer av mitos och kan inaktivera varandra genom hämmande fosforylering. Detta är en dubbel negativ återkopplingsslinga där båda regulatorerna inaktiverar varandra. Enligt Kim et al (2007) måste det finnas ett ultrakänsligt element för att generera ett bistabilt svar. Det visade sig att Wee1 har ett överkänsligt svar på Cdk1, och detta beror troligen på substratkonkurrens mellan olika fosforyleringsställen på Wee1 [8] .
Bistabilitet innebär hysteres och hysteres innebär multistabilitet. Multistabilitet indikerar närvaron av två eller flera stabila tillstånd för en given ingång. Därför är bistabilitet förmågan hos ett system att existera i två stationära tillstånd [9] . Med andra ord finns det en rad stimulusvärden för vilka ett svar kan ha två steady-state-värden. Bistabilitet åtföljs av hysteres , vilket innebär att systemet närmar sig ett av två stabila tillstånd företrädesvis beroende på dess historia. Bistabilitet kräver såväl återkoppling som ett ultrakänsligt kretselement.
Under lämpliga omständigheter kan positiva och negativa återkopplingsslingor ge förutsättningar för bistabilitet; till exempel på grund av den positiva återkopplingen associerad med det ultrakänsliga svarselementet i kretsen. Ett hysteretiskt bistabilt system kan fungera som en tillförlitlig reversibel omkopplare eftersom det är svårare för systemet att växla mellan "på" och "av"-tillstånd (jämfört med ett motsvarande monostabilt överkänsligt svar). Systemet kan också konfigureras så att en av övergångarna är fysiskt oåtkomlig; till exempel kommer ingen mängd stimulusreduktion att återställa systemet till "av"-tillståndet om det redan är i "på"-tillståndet. Detta kommer att bilda en pålitlig irreversibel strömbrytare. Hur man designar en enkel biologisk switch beskrivs i ett konferensbidrag [10] .
Det finns ingen en-till-en-överensstämmelse mellan nätverkstopologier eftersom många nätverk har liknande in- och utgående relationer. Nätverkstopologi innebär inte inmatning eller utdata, och på liknande sätt innebär inmatning eller utdata inte nätverkstopologi. Det är av denna anledning som parametrering är mycket viktig för kretsens funktion. Om dynamiken hos ingången är jämförbar med eller snabbare än systemets respons, kan responsen verka hysteretisk.
Beskrivna nedan är tre cellcykelomkopplare som ger abrupta och/eller irreversibla övergångar genom användning av några av de mekanismer som beskrivs ovan.
G1 /S -övergången , mer känd som kontrollpunkten i spirande jäst (restriktionspunkt i andra organismer), reglerar förloppet av cellcykeln [1] . Vid denna kontrollpunkt stannar cellerna antingen innan de replikerar DNA (på grund av näringsrestriktion eller en feromonsignal), förlänger G1 (storlekskontroll) eller börjar replikering och går igenom resten av cellcykeln. G1/S regulatoriska nätverk eller regulon i spirande jäst inkluderar cykliner G1 Cln1, Cln2 och Cln3, Cdc28 (Cdk1), transkriptionsfaktorer SBF och MBF och transkriptionsinhibitor Whi5 [2] . Cln3 interagerar med Cdk1 för att initiera en sekvens av händelser genom fosforylering av ett brett spektrum av mål inklusive SBF, MBF och Whi5 . Fosforylering av Whi5 får den att flytta ut ur kärnan, vilket förhindrar att den hämmas av SBF och MBF. Aktiv SBF/MBF driver G1/S-övergången, inklusive cykliner av B-typ och initierar DNA-replikation, knoppbildning och spindelduplicering. Dessutom reglerar SBF/MBF uttrycket av Cln1 och Cln2, som också kan interagera med Cdk1 för att främja fosforylering av dess mål.
Denna G1/S-switch ansågs ursprungligen fungera som en linjär sekvens av händelser som börjar vid Cln3 och slutar vid fas S [11] . Observationen att båda Clns var tillräckliga för att aktivera regulonet indikerar dock att Cln1 och Cln2 kanske kan använda positiv feedback för att aktivera sin egen transkription. Detta skulle resultera i en ständigt accelererande cykel som skulle kunna fungera som en irreversibel bistabil flip-flop [2] . Scotheim et al använde encellsmätningar i spirande jäst för att visa att denna positiva feedback verkligen förekommer [2] . En liten mängd Cln3 inducerar uttrycket av Cln1/2, och sedan kommer en återkopplingsslinga till spel, vilket leder till en snabb och abrupt utgång av Whi5 från kärnan och följaktligen ett koherent uttryck av G1/S-regulon-generna. I frånvaro av koherent genuttryck tar det längre tid för celler att lämna G1, och en betydande andel stannar till och med före S-fasen, vilket understryker vikten av positiv feedback för att förbättra G1/S-omkopplaren.
G1/S-cellcykelns kontrollpunkt kontrollerar övergången av eukaryota celler från den första fasen av G1-gapet till DNA-syntesfasen, S. I denna switch i däggdjursceller finns det två cellcykelkinaser som hjälper till att kontrollera kontrollpunkten: cellcyklisk kinaserna CDK4/6-cyklin D och CDK2-cyklin E [1] . Ett transkriptionskomplex inklusive Rb och E2F är viktigt för kontrollen av denna kontrollpunkt. I den första gapfasen binder Rb-HDAC-repressorkomplexet till E2F-DP1-transkriptionsfaktorerna och hämmar därigenom nedströms transkription. Fosforylering av Rb av CDK4/6 och CDK2 dissocierar Rb-repressorkomplexet och fungerar som en cellcykelomkopplare. Efter fosforylering av Rb avlägsnas hämningen av transkriptionsaktiviteten av E2F. Detta möjliggör transkription av gener i S-fas som kodar för proteiner som förbättrar G1-växlingen till S-fas.
Många olika stimuli används för att kontrollera kontrollpunkter, inklusive TGFb, DNA-skada, kontakthämning, replikativt åldrande och tillbakadragande av tillväxtfaktorer. De första fyra verkar genom att inducera medlemmar av INK4- eller Kip/Cip-familjen av cellcykelkinashämmare. TGFb hämmar transkriptionen av Cdc25A, ett fosfatas som aktiverar cellcykelkinaser, och avlägsnande av tillväxtfaktor aktiverar GSK3b, som fosforylerar cyklin D. Detta leder till dess snabba ubiquitination [12] .
G2 börjar med E2F-medierad transkription av cyklin A, som bildar cyklin A-Cdk2-komplexet. För att fortsätta till mitos aktiveras cyklin B - Cdk1-komplexet (först upptäcktes som en faktor som bidrar till MPF- eller M-fas; Cdk1 är också känt som Cdc2 i fissionsjäst och Cdc28 i spirande jäst) av Cdc25 , ett proteinfosfatas [1] ] . När mitosen börjar sönderdelas kärnhöljet, kromosomerna kondenseras och blir synliga och cellen förbereder sig för att dela sig. Aktivering av cyklin B -Cdk1 leder till förstörelsen av kärnmembranet, vilket är typiskt för initieringen av mitos [1] .
Cyklin B-Cdk1-komplexet är involverat i en regleringskrets där Cdk1 kan fosforylera och aktivera sin aktivator, Cdc25 (positiv återkoppling), samt fosforylera och inaktivera dess inaktivator, Wee1 -kinas (dubbel negativ återkoppling) [1] . Denna krets kan fungera som en bistabil vippa [13] med ett stationärt tillstånd i G2 (Cdk1 och Cdc25 av, Wee1 på) och ett andra stationärt tillstånd i fas M (Cdk1 och Cdc25 aktiva, Wee1 av). Wee1 i sig regleras dock av andra faktorer som Cdr2 .
Detta har föreslagits och försvarats av Jin et al. [14] i sin serie av experiment med den mänskliga HeLa-cellinjen 1998 visade att det är det rumsliga arrangemanget av cyklin B inuti cellen som initierar mitos. Som är känt från tidigare experiment med både mänskliga celler och sjöstjärns oocyter, Jin et al. sammanfatta att cyklin B1 finns rikligt i cytoplasman under mitosens icke-delande faser, men identifieras i kärnan i komplex med Cdk1 precis innan cellen går in i mitos. Andra försöksledare har visat att celler inte delar sig om cyklin B finns kvar i cytoplasman. För att ytterligare undersöka effekten av cyklin B rumslig position på celldelning och cykelkontroll, Jin et al. märkt cyklin B med en nukleär lokaliseringssignal (NLS), som håller cyklin inne i kärnan. Inledningsvis producerade denna cyklin B NLS inte den förväntade effekten av ett accelererat inträde i mitos. Detta resultat beror på hämningen som visas i figuren nedan. Wee1, en hämmare av cyklin B-Cdk1-komplexet, är lokaliserad i kärnan och fosforylerar sannolikt cyklin B NLS, vilket gör att det inte kan fungera som avsett. Detta postulat bekräftades när Jin et al. använde Cdc2AF, en icke-fosforylerad mutant av Cdk1, och observerade ett accelererat inträde i celldelning på grund av nukleär lokalisering av cyklin B. Därför är nukleär lokalisering av cyklin B nödvändig men inte tillräcklig för att utlösa celldelning.
I en studie av cellcykelreglering visade Jin et al. manipulerade celler för att bedöma lokaliseringen av cyklin B i celler med DNA-skada. Genom en kombination av DNA-skada och nukleär lokalisering av exogent cyklin B kunde de fastställa att celler skulle dela sig även med DNA-skador om cyklin B tvingades uttryckas i kärnan. Detta indikerar att den rumsliga lokaliseringen av cyklin B kan spela rollen som en mitoskontrollpunkt. Om celler normalt inte delar sig när deras genetiska information är skadad, utan går in i mitos om endogent cyklin B uttrycks i kärnan, är det troligt att translokation av cyklin B till cytoplasman är den mekanism som förhindrar omogen mitotisk inträde. Denna hypotes bekräftades ytterligare av Jin et al. Analys av celler kvarhållna i G2 på grund av DNA-skada. I dessa celler, Jin et al. observerade höga nivåer av aktivitet av cyklin B-Cdc2-komplexet i cytoplasman. Detta bekräftar den tidigare nämnda teorin, eftersom den visar att Cdc2 kan aktivera cyklin utan omedelbar translokation till kärnan. Dessutom stödjer ackumuleringen av cyklin B-Cdk1-komplex i cytoplasman hos celler som inte delar sig på grund av DNA-skada teorin att det är den nukleära lokaliseringen av cyklin B som initierar mitotiskt inträde.
Således spelar den rumsliga lokaliseringen av cyklin B en roll i inträdet i mitos. Translokation av cyklin B från cytoplasman till kärnan är nödvändig för celldelning, men är inte tillräcklig, eftersom dess inhibitorer inte tillåter cellen att gå in i mitos i förtid. Förutom att reservera hämning av cyklin B-Cdk1-komplexet, förhindras för tidig celldelning genom translokation av självt cyklin B. Cyklin B-Cdk1-komplexet kommer att stanna kvar i cytoplasman i celler med DNA-skada snarare än att flytta till kärnan, vilket förhindrar cellen från att hämma cellens inträde i mitos. Nästa fråga som ställs av forskare inom detta område är vilken specifik mekanism som reglerar denna translokation.
Santos et al [15] föreslog att cyklin B-translokation regleras av en positiv återkopplingsmekanism som liknar den som reglerar aktiveringen av cyklin B-Cdk1-komplexet. De trodde att en positiv återkopplingsslinga involverade fosforyleringen av cyklin B och dess translokation till kärnan. För att börja utforska detta bekräftade de först några av resultaten av Jin et al. experiment med immunfluorescens för att visa cyklin B i cytoplasman före delning, och translokation till kärnan för att initiera mitos, vilket de använde, jämfört med nuclear envelope disruption (NEB). Genom att använda nukleärt cyklin, som inte kan inaktiveras av Wee1 eller Myt1, observerade Santos et al. att aktivt nukleärt cyklin rekryterar mer cyklin från cytoplasman för att flytta in i kärnan. De bekräftade denna observation genom att använda iRap-behandling med rapamycin. iRap inducerar translokation av märkt cyklin B från cytoplasman till kärnan. Särskilt Santos et al. såg att omärkt cyklin B migrerar med cyklin B under påverkan av iRap. Omärkt cyklin svarar inte på behandling och rör sig oberoende av behandlat cyklin. Detta bekräftar den första delen av den positiva återkopplingsslingan att nukleär lokalisering av cyklin B, vilket leder till mitotiskt inträde, främjar ökad translokation av cytoplasmatiskt cyklin B in i kärnan, vilket ytterligare underlättar migreringen av det återstående cytoplasmatiska cyklin B in i kärnan, etc. .
Santos et al föreslår vidare att cyklin B-fosforylering är en annan komponent i den positiva återkopplingsslingan. De märkte att cyklin B naturligt kommer in i kärnan före NEB. Däremot kommer muterat, icke-fosforylerat cyklin B in i kärnan under NEB. Detta är överraskande eftersom det är karakteristiskt för cellcykeln att flytta cyklin in i kärnan före NEB för att få cellcykeln att utvecklas till mitotisk delning. Således har Santos et al. dra slutsatsen att fosforylering av cyklin B främjar translokation till kärnan. Emellertid främjar translokation till kärnan cyklin-fosforylering. Författarna noterar att fosforyleringen av cyklin B i kärnan är nitton gånger gynnsammare än i cytoplasman på grund av den mindre totala volymen av kärnan, vilket ger en högre fosforyleringshastighet. Ökad translokation på grund av fosforylering och ökad fosforylering på grund av translokation illustrerar en positiv återkopplingsslinga som liknar den tidigare upptäckt som aktiverar cyklin B-Cdk1-komplexet.
Sammanfattningsvis krävs nukleär lokalisering av cyklin B för cellinträde i mitos. Translokationen av cyklin från cytoplasman till kärnan, vilket säkerställer celldelning, regleras av en positiv återkopplingsslinga. Aktivt cyklin B rör sig in i kärnan och främjar aktiveringen och rörelsen av ytterligare cyklinenheter som finns i kärnan. Detta fenomen förstärks när man överväger fosforylering. Fosforylering av cyklin B främjar nukleär translokation, och cyklin B i kärnan är mycket mer sannolikt att fosforyleras, så nukleär lokalisering främjar i sin tur cyklin B-fosforylering.
När cellerna är i mitos aktiverar cyklin B-Cdk1 det anafasstimulerande komplexet (APC), vilket i sin tur inaktiverar cyklin B-Cdk1 genom att bryta ned cyklin B, vilket så småningom leder till utträde ur mitos. Kombinationen av den bistabila responsfunktionen hos Cdk1 med negativ feedback från APC kan generera den så kallade relaxationsoscillatorn [3] med skarpa skurar av Cdk1-aktivitet som utlöser stabila mitotiska cykler. Men i relaxationsoscillatorn rör sig styrparametern långsamt med avseende på systemets svarsdynamik, vilket kan vara en korrekt representation av mitotisk input, men inte nödvändigtvis mitotisk utsignal.
Det är nödvändigt att inaktivera cyklin B-Cdk1-komplexet för att lämna det mitotiska skedet av cellcykeln. Cellerna kan sedan återgå till den första fasen av G1-gapet och vänta tills cykeln fortsätter igen.
År 2003, Pomerening et al. gav starka bevis för denna hypotes genom att demonstrera hysteres och bistabilitet i Cdk1-aktivering i cytoplasmatiska extrakt av Xenopus -oocyter [3] . De visade först ett intermittent spiksvar av Cdk1 på en förändring i koncentrationen av icke-nedbrytbart Cyclin B (för att frikoppla Cdk1-svarsnätverket från APC-medierad negativ feedback). Ett sådant svar kommer emellertid att motsvara både en monostabil överkänslig övergång och en bistabil övergång. För att skilja mellan dessa två möjligheter mätte de steady-state-nivåer av aktivt Cdk1 som svar på ändrade cyklinnivåer, men i två separata experiment började det ena med ett interfasextrakt och det andra började med ett extrakt som redan var i mitos. Vid mellanliggande koncentrationer av cyklin fann de två stationära koncentrationer av aktivt Cdk1. Vilket av de två stationära tillstånden som var upptaget berodde på systemets historia, dvs om de började med ett interfas- eller mitotiskt extrakt, vilket effektivt uppvisade hysteres och bistabilitet.
Samma år nådde Sha et al [16] oberoende av varandra samma slutsats genom att hitta en hysteresloop som också använde Xenopus laevis-äggextrakt. Tre förutsägelser av Nowak-Tyson- modellen testades i denna artikel för att dra slutsatsen att hysteres är drivkraften bakom "cellcykelövergångar in och ut ur mitos". Förutsägelserna från Nowak-Tyson-modellen är gemensamma för alla sadelpunktsförgreningar. Sadelpunktsbifurkationer är extremt användbara i en ofullkomlig värld eftersom de hjälper till att beskriva ofullkomliga biologiska system. Den första förutsägelsen var att tröskelkoncentrationen av cyklin för att gå in i mitos är högre än tröskelkoncentrationen av cyklin för att lämna mitos, och detta bekräftades genom tillskott av cykliska äggextrakt med icke-nedbrytbart cyklin B och mätning av aktiverings- och inaktiveringströskeln efter tillsats av cykloheximid (CHX), som är en hämmare av proteinsyntes [1] . Dessutom bekräftades också den andra förutsägelsen av Nowak-Tyson-modellen: oreplikerad deoxiribonukleinsyra, eller DNA, ökar tröskelkoncentrationen av cyklin som krävs för att komma in i mitos. För att nå denna slutsats sattes CHX, APH (DNA-polymerashämmare) eller båda och icke-nedbrytbart cyklin B till extrakten som frisätts av den cytostatiska faktorn. Den tredje och sista förutsägelsen som testades och bekräftades i denna artikel var att hastigheten för Cdc2-aktivering saktar ner nära tröskelkoncentrationen för cyklinaktivering. Dessa förutsägelser och experiment visar växlingsbeteende som liknar växling, vilket kan beskrivas genom hysteres i ett dynamiskt system [17] .
Under övergången från metafas till anafas är det extremt viktigt att systerkromatider separerar korrekt och samtidigt i motsatta ändar av cellen [1] . Systerkromatidseparation är initialt starkt hämmad för att förhindra för tidig separation i sen mitos, men denna hämning dämpas genom förstörelse av de hämmande elementen av det anafasstimulerande komplexet (APC) när systerkromatidbiorientering har uppnåtts. Ett sådant hämmande element är securin , som förhindrar förstörelsen av kohesin , komplexet som håller ihop systerkromatider, genom att binda till ett proteasseparas , som riktar sig mot Scc1 , en subenhet av kohesinkomplexet, för destruktion. I detta system kan Cdc14- fosfatas avlägsna hämmande fosfat från securin, och därigenom underlätta nedbrytningen av APC-securin genom att frigöra separas. Som visas av Uhlmann et al., under fästningen av kromosomer till den mitotiska spindeln, förblir kromatider i par, eftersom bindning mellan systrar förhindrar separation [8] [18] . Kohesion etableras under DNA-replikation och beror på cohesin, som är ett multi-subunit-komplex bestående av Scc1, Scc3, Smc2 och Smc3. I jäst, under övergången från metafas till anafas, dissocierar Scc1 från kromosomerna och systerkromatider separeras. Denna verkan kontrolleras av Esp1-proteinet, som är tätt bundet till anafashämmaren Pds1, som bryts ned av det anafasstimulerande komplexet. För att verifiera att Esp1 verkligen spelar en roll i regleringen av Scc1-kromosomassociation, arresterades cellstammar vid G1 med alfafaktor. Dessa celler förblev i ett tillstånd av arrest under utvecklingen. Mutant Esp1-1-celler användes och experimentet upprepades, med Scc1 framgångsrikt bindande till kromosomer och förblev associerad även efter upphörande av syntesen. Detta var viktigt för att visa att med Esp1 hindras förmågan hos Scc1 att bli stabilt associerad med kromosomer under G1, och Esp1 kan faktiskt ta bort Scc1 från kromosomerna direkt.
Detta har visats av Holt et al. [4] att separas aktiverar Cdc14, som i sin tur verkar på securin, vilket skapar en positiv återkopplingsslinga som förbättrar metafas-till-anafas-övergångsklarheten och koordinationen av systerkromatidseparationen [19] . Holt et al undersökte grunden för den positiva feedback-effekten på securin-fosforylering med hjälp av mutanta securin-jäststammar och testade hur förändringar i securin-fosforreglering påverkar synkroniseringen av systerkromatidseparation. Deras resultat indikerar att interferens med denna securin-separase-cdc14 positiva loop minskar synkroniseringen av systerkromatidseparation. Denna positiva feedback kan hypotetiskt generera bistabilitet vid övergången till anafas, vilket får cellen att fatta ett oåterkalleligt beslut att separera systerkromatider.
Utgången från mitos är en viktig övergångspunkt som markerar slutet på mitosen och början på en ny G1-fas för cellen, och cellen måste förlita sig på specifika kontrollmekanismer så att den efter att ha lämnat mitosen aldrig återgår till mitosen förrän den är komplett. Klarade steg G1, S och G2 och klarade alla nödvändiga kontrollpunkter. Många faktorer, inklusive cykliner , cyklinberoende kinaser (CDKs), ubiquitinligaser , hämmare av cyklinberoende kinaser och reversibel fosforylering , reglerar mitotisk exit för att säkerställa att cellcykelhändelser inträffar i rätt ordning med minsta möjliga fel [20] . Slutet av mitos kännetecknas av sönderfallet av spindeln, förkortningen av kinetochore mikrotubuli och den uttalade utväxten av astrala (nonkinetochore) mikrotubuli [21] . För en normal eukaryot cell är utträde från mitos irreversibel [22] .
Många förslag har gjorts angående kontrollmekanismerna som används av cellen för att säkerställa irreversibiliteten av utträde från mitos i en eukaryot modellorganism, den spirande jästen Saccharomyces cerevisiae . Proteolytisk nedbrytning av cellcykelregulatorer och motsvarande effekt på nivåerna av cyklinberoende kinaser har föreslagits som en mekanism som främjar den eukaryota cellcykeln och i synnerhet övergången från metafas till anafas. I denna teori främjar det anafasstimulerande komplexet (APC), en klass av ubiquitinligas, nedbrytningen av mitotiska cykliner (Clb2) och anafasinhiberande faktorer (PDS1, CUT2) för att främja mitosexit [23] . APC ubiquitinerar ett nio-aminosyror motiv känt som en disruption box (D-box) i den NH2-terminala domänen av mitotiska cykliner för proteasomnedbrytning [23] . APC i förening med Cdc20 (APC-Cdc20) ubiquitinates och riktar sig mot mitotiska cykliner (Clb2) för nedbrytning i den initiala fasen. Samtidigt medierar APC-Cdc20 nedbrytningen av securiner, som hämmar separaser genom att binda tidigt i anafas. Det frigjorda och aktiva separaset klyver kohesin, som håller systerkromatider samman, underlättar systerkromatidseparation och initierar mitotisk exit, vilket främjar frisättningen av Cdc14 från nukleolen [24] [25] . I en senare fas främjar nedreglering av Cdk1 och aktivering av Cdc14, ett Cdh1-aktiverande fosfatas, bildandet av APC i förening med Cdh1 (APC-Cdh1) för att bryta ned Clb2 [22] . Cdc20 och Cdh1, som är APC-aktivatorer, rekryterar substrat som securin och B-typ cykliner (Clb) för ubiquitination [26] . Utan Cdk1-Clb2-komplex för att fosforylera proteiner som är involverade i spindeldynamik, såsom Sli15, Ase1 och Ask1 , säkerställs spindelförlängning och kromosomal segregation, vilket underlättar utträde från mitos [22] . Vikten av proteolytisk nedbrytning i den eukaryota cellcykeln har förändrat synen på celldelning som en enkel kinaskaskad till en mer komplex process som kräver interaktioner mellan fosforylering, ubiquitination och proteolys [23] . Experiment med spirande jästceller med cdc28-as1, en INM-PP1 (ATP-analog)-känslig Cdk-allel, har dock visat att förstörelse av cykliner av B-typ (Clb) inte är nödvändig för att utlösa irreversibel utträde från mitos [22] . Clb2-nedbrytning förkortar den period av Cdk1-hämning som krävs för att utlösa irreversibel mitotisk exit, vilket indikerar att cyklinproteolys bidrar till den dynamiska karaktären hos den eukaryota cellcykeln på grund av dess långsammare verkningstid, men det är osannolikt att det är den viktigaste avgörande faktorn för att utlösa en irreversibel cellcykel.. övergångar [22] .
Upptäckter har gjorts som indikerar betydelsen av nivån av inhibitorer av cyklinberoende kinaser i regleringen av den eukaryota cellcykeln. I synnerhet har det visats att nivån av Sic1 , en stökiometrisk hämmare av Clb-CDK-komplex i spirande jäst, är särskilt viktig för den irreversibla G1-S-övergången på grund av den irreversibla aktiveringen av S-fas kinaser [27] . Det har visat sig att Sic1-nivån spelar en viktig roll för att utlösa det irreversibla utträdet från mitos (M-G1-övergång) såväl som i G1-S-övergången. Under mitos leder en minskning av Cdk1-nivåerna till aktiveringen av Cdc14, ett fosfatas som motverkar Cdk1 genom aktiveringen av Cdh1 och Swi5, en transkriptionell aktivator av Sic1-proteinerna [28] . Medan nedbrytning av Sic1 till en viss låg nivå utlöste S-fas, krävdes ackumulering av Sic1 till en viss hög nivå för att utlösa irreversibel utträde från mitos [22] . Cdk1-hämmare kan inducera mitotisk exit även när nedbrytningen av cykliner av B-typ blockeras av uttrycket av icke-nedbrytbara Clbs eller proteasomhämmare. Systerkromatider misslyckas dock med att segregera och celler återgår till mitos efter att inhibitorer tvättats ut, vilket indikerar att en tröskelnivå av inhibitorer måste nås för att utlösa irreversibel mitotisk exit oberoende av cyklinnedbrytning [29] . Trots de olika Sic1-nivåtröskelvärdena som krävs för att utlösa mitotisk exit jämfört med G1-S-övergången har Sic1-nivån visat sig spela en nyckelroll i regleringen av den eukaryota cellcykeln genom att hämma CDK-aktivitet.
Eftersom den eukaryota cellcykeln involverar många proteiner och regulatoriska interaktioner, kan en dynamisk systemmetod användas för att förenkla en komplex biologisk kedja till en gemensam struktur för bättre analys [30] . Bland de fyra möjliga input/output-relationerna verkar förhållandet mellan Sic1-nivå och mitotisk utgång uppvisa egenskaper hos en irreversibel bistabil switch som drivs av återkoppling mellan APC-Cdh1, Sic1 och Clb2-Cdk1 [22] . Bistabilitet är känd för att styra biologiska funktioner såsom cellcykelkontroll och celldifferentiering och spelar en nyckelroll i många cellulära regulatoriska nätverk [31] . En bistabil in-/utgångsförbindelse kännetecknas av två stabila tillstånd med två bifurkationspunkter. Flera utgångar är möjliga för en speciell ingång i området för bistabilitet som markeras av två bifurkationspunkter. Dessutom uppvisar bistabil koppling hysteres: det slutliga tillståndet/utgången beror på ingångens historia såväl som det aktuella värdet på ingången, eftersom systemet har ett minne [32] . En bifurkationspunkt har ett negativt värde på kontrollparametern (bifurkationspunkten är på andra sidan av axeln), vilket leder till ett gap mellan de två stabila tillstånden och irreversibiliteten för övergången från ett tillstånd till ett annat. När det gäller utträde från mitos bestäms de två stabila tillstånden av mitos och G1-fasen. När nivån av Sic1 (ingång) överstiger tröskeln, sker en irreversibel övergång från mitos (stabilt tillstånd I) till G1-fasen (stabilt tillstånd II). I en ofullkomlig miljö är den enda bifurkationen som förblir oförändrad sadel-nodbifurkationen . Sadelnodens bifurkation bryts inte (sadelnoden är det förväntade allmänna beteendet), medan transkritiska bifurkationer och gaffelbifurkationer inte kränks i närvaro av brister [33] . Således är den enda endimensionella bifurkationen som kan existera i en ofullkomlig biologisk värld sadel-nodbifurkationen [32] . Den bistabila kopplingen mellan M-G1-övergången och Sic1-nivån kan representeras som ett diagram av två sadel-nodbifurkationer, där systemets beteende kvalitativt förändras med en liten förändring i kontrollparametern, värdet på Sic1.
Eftersom cellcykelns beteende är kritiskt beroende av mängden Sic1 i M-G1-övergångstillståndet, regleras mängden Sic1 hårt av återkoppling på systemnivå. Eftersom Cdk1-Clb2 hämmar Sic1 genom att fosforylera Sic1 och göra Sic1 tillgängligt för nedbrytning via ubiquitination, minskar APC-Cdh1-beroende nedbrytning av Cdk1-Clb2 inte bara nivån av tillgängliga Cdk1-Clb2-komplex, utan ökar också nivån av Sic1, vilket i sväng ytterligare mer hämmar funktionen av Cdk1-Clb2 [28] . Denna dubbla negativa återkopplings-aktivering initieras av APC-Cdc20-beroende nedbrytning av Cdk1-Clb2 och frisättning av Cdc14 från det nukleolära Net1/Cfi1-proteinet [34] . FEAR (anaphase early release of Cdc14)-vägen underlättar Clb2-Cdk1-beroende Net1-fosforylering, som övergående frisätter Cdc14 från Net1 [35] . De frigjorda Cdc14- och Clb2-Cdk1-komplexen passerar in i spindeln, vilket aktiverar mitosexitnätverket (MEN). MEN säkerställer fördröjd frisättning av Cdc14 från kärnan [35] och Cdc14 motverkar Clb2-Cdk1-aktivitet genom att aktivera Cdh1 och stabilisera Sic1 via aktivering av Sic1-transkriptionsaktivatorn Swi5 [36] . Sic1 reglerar sig själv positivt genom att hämma Cdk1-Clb2 för att frigöra Swi5-hämning, och Cdh1 reglerar sig också positivt genom att hämma Clb2-Cdk1 för att frigöra MEN-hämning, vilket kan aktivera Cdc14 och sedan Cdh1 själv. Den dubbla negativa återkopplingsslingan som bildas av APC-Cdh1 och Sic1 är nödvändig för att upprätthålla låg Clb2-Cdk1-aktivitet, eftersom Clb2 automatiskt aktiverar sin syntes genom att aktivera transkriptionsfaktorer, Fkh2-Mcm1 Ndd1 - komplexet [28] .
Den eukaryota cellcykeln består av olika kontrollpunkter och återkopplingsslingor för att säkerställa korrekt och framgångsrik celldelning. Till exempel, under mitos, när duplicerade kromosomer är felaktigt fästa till den mitotiska spindeln, hämmar proteiner för spindelsammansättningskontrollpunkt (SAC), inklusive Mad och Bub, APC-Cdc20, vilket fördröjer inträde i anafas och nedbrytning av cyklin av B-typ . Dessutom, när mitotiska spindlar förskjuts, hämmas MEN och därefter Cdc14 av Bub2 och Bfa1-beroende för att förhindra nedbrytning av mitotiska cykliner och inträde i anafas [36] . Sic1 är ett bra exempel på hur återkopplingsslingor på systemnivå interagerar för att känna av miljöförhållanden och utlösa cellcykelövergångar. Även om den faktiska M-G1-övergången är extremt komplex och involverar många proteiner och regleringar, tillåter det dynamiska systemets tillvägagångssätt oss att förenkla detta komplexa system till ett bistabilt input/output-förhållande med två sadelnodbifurkationer där utsignalen (mitotisk produktion) beror på kritisk koncentration. Sic1. Med hjälp av univariat analys skulle man kunna förklara de många irreversibla övergångspunkterna i den eukaryota cellcykeln som regleras av kontroll och återkoppling på systemnivå. Andra exempel på irreversibla övergångspunkter inkluderar Start (ett irreversibelt engagemang för en ny cykel av celldelning), vilket kan förklaras av en irreversibel bistabil omkopplare, vars kontrollparameter är hårt reglerad av systemåterkopplingar, inklusive Cln2, Whi5 och SBF [ 37] .
| cellcykeln | |||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Faser |
| ||||||||||
| Regulatorer |
| ||||||||||