Western blotting (western blot, protein immunoblot, eng. Western blot ) är en analytisk metod som används för att bestämma specifika proteiner i ett prov . Det första steget använder proteinelektrofores i en polyakrylamidgel för att separera denaturerade polypeptider efter längd (vanligtvis i närvaro av SDS ) eller tredimensionell struktur av proteinet (i det naturliga tillståndet). Därefter överförs proteinerna till ett nitrocellulosa- eller PVDF- membran och detekteras sedan med antikroppar specifika för ett givet protein [1] [2] .
Det finns många kommersiella företag som specialiserar sig på produktion av antikroppar (både monoklonala och polyklonala ) mot tiotusentals olika proteiner [3] .
Western blotting används inom molekylärbiologi , biokemi , genetik och andra naturvetenskapliga discipliner.
Andra liknande metoder använder antikroppar för att detektera proteiner i vävnader och celler genom immunfärgning och enzymkopplad immunosorbentanalys ( ELISA ) .
Western blotting utvecklades i George Starks laboratorium i Stanford . Namnet Western Blot gavs till tekniken av W. Neal Burnette [4] och är en lek med ord från namnet Southern Blot , en DNA- detektionsteknik som tidigare utvecklats av Edwin Southern . En liknande metod för att bestämma RNA kallas northern blotting , detektionen av post - translationella proteinmodifieringar kallas Eastern blotting .
Provet kan tas från hel vävnad eller från cellkultur. I de flesta fall mals hårda vävnader först med hjälp av en mixer (för stora volymprover), en homogenisator (mindre volymer) eller sonikering . Samtidigt är bakterier, virus och andra miljökomponenter också en källa till proteiner.
Olika rengöringsmedel , salter och buffertar kan användas för att förbättra celllys och proteinupplösning . Proteas- och fosfatashämmare tillsätts ofta för att förhindra att prover smälts av deras egna enzymer . Vävnadsberedning utförs ofta vid låga temperaturer för att undvika proteindenaturering .
Kombinationer av biokemiska och mekaniska fraktioneringstekniker, inklusive olika typer av filtrering och centrifugering , används för att separera olika cellulära avdelningar och organeller .
Proteiner separeras med hjälp av polyakrylamidgelelektrofores. Separation av proteiner kan göras genom isoelektrisk punkt (pI), molekylvikt , elektrisk laddning eller en kombination av dessa parametrar.
Den vanligaste metoden för att separera proteiner är elektrofores i polyakrylamidgel i närvaro av natriumdodecylsulfat ( SDS ) enligt Laemmli . [5] SDS orsakar denaturering av proteiner och håller dem i ett denaturerat tillstånd; disulfidbindningsreducerande medel, såsom ditiotreitol och merkaptoetanol , används för att förstöra de sekundära och tertiära strukturerna av proteiner . Denaturerade polypeptider migrerar i det elektriska fältet genom akrylamidgelen till anoden , med mindre proteiner som rör sig snabbare och separerar således efter molekylvikt. Koncentrationen av akrylamid bestämmer upplösningen av gelén - ju högre koncentration av akrylamid, desto bättre upplösning av proteiner med liten molekylvikt. En låg koncentration av akrylamid förbättrar upplösningen för proteiner med hög molekylvikt. Det är också möjligt att använda tvådimensionell elektrofores (2-D) . I detta fall utförs separationen av proteiner i två riktningar - i enlighet med deras isoelektriska punkt i den första riktningen och i enlighet med molekylvikten - i den andra.
Prover på gelén appliceras på fickorna. Som regel lämnas ett av "spåren" för molekylviktsmarkörer (blandningar av proteiner med kända massor). Efter att spänningen applicerats rör sig proteinerna i det elektriska fältet med olika hastigheter. Skillnader i framstegshastighet - elektroforetisk rörlighet - leder till separation av proteiner i band ( engelska bands ).
För att göra proteiner tillgängliga för antikroppar och ytterligare detektion överförs de tillsammans med en gelremsa till ett membran av nitrocellulosa eller polyvinylidenfluorid ( PVDF ) . Membranet appliceras över gelén och en bunt filterpapper placeras ovanpå den. Hela stapeln placeras i överföringsbufferten, som under inverkan av kapillärverkan rör sig upp på papperet och bär med sig proteinerna. En annan metod för att överföra proteiner kallas elektroblotting och använder en elektrisk ström för att överföra proteiner från gelén till membranet. Proteiner rör sig från gelén till membranet samtidigt som de behåller sin plats. Som ett resultat av denna "blotting"-process (från engelska blotting ) hålls proteiner kvar på ett tunt ytskikt av detektionsmembranet. Båda membranvarianterna används på grund av deras ospecifika proteinbindande egenskaper. Proteinbindning är baserad på både hydrofoba interaktioner och elektrostatiska interaktioner mellan membran och protein. Nitrocellulosamembran är billigare än PVDF, men är mycket mer spröd och mindre motståndskraftig mot ommärkning.
Likformigheten och den totala effektiviteten av överföringen av proteiner från gelén till membranet kan kontrolleras genom att färga membranet med Coomassie blue eller Ponceau S- färger . Coomassie är den vanligaste av de två, medan Ponceau S är mer känslig och vattenlöslig, vilket gör efterföljande rengöring och märkning av membranet lättare. [6]
När ett membran väl har valts ut för dess förmåga att binda proteiner, antikroppar och målprotein har valts ut måste man vara försiktig så att man undviker interaktion mellan membranet och antikroppen som används för att detektera målproteinet (eftersom antikroppen i sig är ett protein). Blockering av icke-specifik bindning uppnås genom att placera membranet i en utspädd proteinlösning - vanligtvis bovint serumalbumin eller fettfri torrmjölk (båda billiga), med en liten andel av ett tvättmedel såsom Tween 20 eller Triton X-100 . Proteinet från den utspädda lösningen är fäst vid membranet på alla ställen där målproteinet inte har fäst. Därför, när antikroppar tillsätts, är den enda fria platsen på membranet där de kan fästa bindningsställena på specifika målproteiner. Detta bakgrundsljud i den sista westernblotten resulterar i rena resultat och eliminering av falska positiva resultat.
Under detektionsprocessen "märks" membranet med proteinet av intresse med en modifierad antikropp som är bunden till ett reporterenzym som hålls på ett lämpligt underlag, vilket leder till en kolorimetrisk reaktion och ger färg. Av olika anledningar utförs detektering i två steg, även om en enstegsdetekteringsmetod nu finns tillgänglig för vissa applikationer.
Antikroppar produceras genom att exponera en värdklass eller en kultur av immunceller för något protein (eller en del av det). Detta är vanligtvis en del av immunsvaret, men här (i analysen) används de insamlade antikropparna som ett specifikt och känsligt detektionsverktyg som binder direkt till proteinet.
Efter blockering inkuberas den utspädda primära antikroppslösningen (vanligtvis mellan 0,5 och 5 µg/ml) med membranet och skakas försiktigt. Vanligtvis består lösningen av en buffrad saltlösning med en liten andel tvättmedel, ibland mjölkpulver eller BSA. Antikroppslösningen och membranet kan stängas ihop och inkuberas var som helst från 30 minuter till över natten. De kan också inkuberas vid olika temperaturer, vid förhöjda temperaturer observeras bättre bindning - både specifik (av målproteinet, "signal1") och ospecifik ("brus").
Efter sköljning av membranet för att avlägsna obundna primära antikroppar, exponeras membranet för andra antikroppar som binder direkt till de klassspecifika regionerna av de primära antikropparna. Dessa är kända som sekundära antikroppar och, enligt deras målegenskaper, kallas de vanligtvis för "anti-mus", "anti-get" och så vidare. Antikroppar erhålls från en djurkälla (eller animaliska källor för hybridomkultur ); sekundära antikroppar mot mus kommer att binda till de flesta primära antikroppar som härrör från mus. Detta skapar vissa besparingar genom att tillåta ett enskilt laboratorium att använda en enda källa för massproduktion av antikroppar, och leder till mycket mer reproducerbara resultat. Sekundära antikroppar är vanligtvis bundna till biotin eller till ett reporterenzym som alkaliskt fosfatas eller pepparrotsperoxidas . Detta innebär att flera sekundära antikroppar kan binda till en primär och förstärka signalen.
De vanligaste pepparrotsperoxidasrelaterade sekundära antikropparna används för att skära det kemiluminescerande medlet, och reaktionsprodukten producerar luminiscerande strålning i proportion till mängden protein. Ett ark av fotokänslig fotografisk film placeras mot membranet och exponeras för reaktionsstrålning, vilket skapar en bild av antikroppsbanden på blotten. Ett billigare men mindre känsligt tillvägagångssätt med 4-kloronaftolfärgning blandad med 1 % väteperoxid ; reaktionen av peroxidradikalen med 4-kloronaftol ger en mörkbrun färg, som registreras utan användning av en speciell fotografisk film.
Liksom med ELISPOT och ELISA kan enzymet förses med en substratmolekyl som omvandlas av enzymet till en färgad reaktionsprodukt som kommer att vara synlig på membranet (se blåbandad figur nedan).
En annan sekundär antikroppsdetektionsmetod använder antikroppar med en bunden fluorofor som emitterar i det nära infraröda (NIR). Ljuset som emitteras av det fluorescerande färgämnet är konstant och gör fluorescensdetektion till ett mer exakt och känsligt sätt att mäta skillnaden i signal som produceras av proteiner märkta med antikroppar på en Western blot. Proteiner kan kvantifieras eftersom signalen beräknas som skillnaden (strålning) i förhållande till alla proteiner på membranet, mätt i vila, till (strålningen) av kemiluminescens, som mäts dynamiskt. [7]
En tredje alternativ metod använder en radioaktiv märkning istället för ett enzym bundet till en sekundär antikropp, såsom märkt Staphylococcus Protein A-typ antikroppsbindande protein med en radioaktiv isotop av jod. Andra metoder är säkrare, snabbare och billigare, så radioaktiv detektering används sällan.
Historiskt har märkningsprocessen genomförts i två steg eftersom det är relativt lättare att producera primära och sekundära antikroppar i separata processer. Detta ger forskare och företag en enorm fördel när det gäller flexibilitet och lägger till ett förstärkningssteg till upptäcktsprocessen. Med tanke på tillkomsten av proteinanalyser med hög genomströmning och låga detektionströsklar, finns det fortfarande intresse för att utveckla ett ettstegsmärkningssystem som gör att processen går snabbare och till lägre kostnad. Det (ett enstegssystem) kräver antikroppstaggar som skulle känna igen proteinet som studeras och samtidigt bära en markör för detektion - de taggar som är mest tillgängliga för de kända "proteinsvansarna". Först inkuberas etiketterna med ett tvåstegsmembran med primära antikroppar, och sedan är de redo för direkt detektering efter en serie tvättar.
Efter tvättning av obundna etiketter är Western blot redo att detektera prober bundna till målproteinet. I praktiken visar inte alla western proteiner med bara ett band på membranet. Ungefärlig storlek beräknas genom att jämföra de färgade banden med molekylviktsmarkörer tillsatta genom elektrofores. Processen kommer att upprepas med strukturella proteiner som aktin eller tubulin som inte förändras mellan experimenten. Mängden målprotein beror på mängden strukturellt kontrollprotein mellan grupperna. Denna teknik ger en korrigering av mängden totalt protein på membranet i händelse av ett fel eller ofullständig överföring.
Den kolorimetriska detektionsmetoden är baserad på inkubation av en Western blot med ett substrat som reagerar med ett reporterenzym (som pepparrotsperoxidas ) , "sitter" på en sekundär antikropp . Det lösliga färgämnet ändras till en olöslig form av en annan färg, fälls ut bredvid enzymet och färgar membranet. Fläcktillväxt begränsas genom att tvätta bort det lösliga färgämnet. Nivån av protein bedöms densitometriskt genom färgningsintensitet eller spektrofotometriskt .
Den kemiluminescerande detektionsmetoden är baserad på inkubation av ett nitrocellulosamembran med ett substrat som luminescerar efter interaktion med en sekundär antikroppsreporter. Ljuset spelas in av en fotografisk film eller CCD - kamera, som digitalt fångar en Western blot. Bilden analyseras densitometriskt , uppskattning av den relativa mängden färgat protein och ger ett kvantitativt resultat i enheter av optisk densitet. Den nya mjukvaran tillåter ytterligare dataanalys, såsom molekylviktsbestämning, om en lämplig standard har använts.
Radioaktiva märkningar kräver inga enzymsubstrat, men tillåter medicinsk radiografisk film att placeras framför en Western blot, vilket gör att den (filmen) kan interagera med märkningarna och skapa mörka områden som motsvarar banden i proteinet som studeras (i bilden till höger). Efterfrågan på radioaktiva detektionsmetoder minskar på grund av deras höga kostnader, höga hälso- och säkerhetsrisker och alternativ som tillhandahålls av ECL.
Fluorescerande etiketter exciteras av ljus och avger ljus med längre våglängder, vilket detekteras av fotosensorer som en CCD- kamera utrustad med lämpliga emissionsfilter. Kameran tar en digital bild av westernblotten, vilket möjliggör ytterligare analys av de inhämtade data, såsom molekylviktsanalys och kvantitativ westernblotanalys.