Enkelcells DNA-sekvensering

Den aktuella versionen av sidan har ännu inte granskats av erfarna bidragsgivare och kan skilja sig väsentligt från versionen som granskades den 12 oktober 2019; kontroller kräver 5 redigeringar .

Encellig DNA-sekvensering är ett  tillvägagångssätt som gör det möjligt att erhålla data om DNA- sekvensen för en enskild cell med hjälp av sekvensering och därför identifiera skillnader mellan individuella celler av encelliga organismer , organ, vävnader och cellsubpopulationer av flercelliga organismer . Tillvägagångssättet gör det möjligt att analysera cellens funktionella egenskaper i samband med mikromiljön. Encellsgenomsekvensering involverar flera steg: encellsisolering, helgenomamplifiering , biblioteksgenerering och DNA-sekvensering med hjälp av nästa generations sekvenseringstekniker .

Med tillkomsten av en mängd olika sekvenseringsmetoder blev det möjligt att fastställa sekvensen av genomiskt DNA. De flesta data hittills har dock erhållits genom att sekvensera genomiska DNA-prover isolerade från populationer av mikroorganismer eller cellsubpopulationer av flercelliga organismer [1] . Det är dock känt att mångfald inom båda grupperna kan vara betydande, eftersom cellerna själva ger olika bidrag till existensen av en population eller organism.

Sekvensering av genomet i en enskild cell gör det möjligt att överföra studiet av genomet till cellnivån. Idag hjälper det till att lösa sådana problem som de novo sekvensering av icke-odlingsbara mikroorganismer [2] , studera genetisk mosaicism i normala och patologiska fall [3] , identifiera och studera bidraget från tumörcellssubpopulationer till cancerutveckling och uppkomst av behandlingsresistens [4] .

Tekniska utmaningar

Encells-DNA-sekvensering ställs inför utmaningarna med att fysiskt isolera enskilda celler , välja en amplifieringsmetod med minsta potential för att introducera fel för att erhålla en tillräcklig mängd material, och välja en sekvenseringsmetod [5] [6] .

Isolering av enstaka celler

Det första steget i cellisolering är att skapa en suspension av livskraftiga celler som inte är anslutna till varandra. Syftet med isoleringen kan vara antingen ett slumpmässigt urval av celler för att skapa ett representativt urval när man analyserar sammansättningen av subpopulationer, eller en riktad sökning efter specifika celler. Vid studier av hårda vävnader är preliminär mekanisk eller kemisk dissociation av provet nödvändig, och dissociationsförhållandena bör verka lika på alla subpopulationer av vävnadsceller. Detta är nödvändigt för att skapa ett prov som är opartiskt i förhållande till den ursprungliga uppsättningen av celler , där den ursprungliga representationen av celler bevaras, vilket kan vara viktigt för att analysera sammansättningen av subpopulationer. Man bör komma ihåg att villkoren för dissociation av normala och ohälsosamma vävnader kan skilja sig åt, så i detta skede är det viktigt att välja lämpliga förhållanden. Att arbeta med hela vävnadsprover är också möjligt, till exempel med hjälp av laserinfångningsmikrodissektion [7] .

Efter att ha erhållit suspensionen kan celler isoleras genom serieutspädning [8] , mikropipettering [9] , mikrobrunnsspädning [10] med en optisk pincett . Fluorescerande flödescytometri kan användas för att isolera celler med specifika fluorescerande egenskaper, som antingen kan vara naturliga eller introduceras av försöksledaren. Automatiserade metoder för mikromanipulation [11] [12] har nyligen fått stor utveckling , inklusive isolering av celler på chip med hjälp av mikrofluidikteknologier [13] ; att ta nanobiopsier gör det redan möjligt att studera individuella organellers DNA [14] . De isolerade cellerna genomgår därefter lys .

Helgenomförstärkning

Nästa steg, helgenomamplifiering  (WGA ), används för att generera tillräckligt med DNA för att detektera signalen och extrahera den från bruset i framtiden under sekvensering. Samtidigt är det önskvärt att minimera införandet av sådana artefakter som den föredragna amplifieringen av enkla sekvenser, införandet av slumpmässiga mutationer och bildandet av chimära sekvenser. Nyligen har en uppsättning möjligheter dykt upp för att lösa detta problem. Användningen av PCR har inte motiverat sig, till exempel på grund av den ökade frekvensen av att introducera fel av termostabila polymeraser . Därför är isotermiska och hybridmetoder, såsom metoden för amplifiering med multiple deplacement amplification ( English  Multiple displacement amplification, MDA ) och amplifiering med multiple rectification and looping ( English  Multiple Annealing and Looping Based Amplification Cycles, MALBAC ) [15] .

MDA

MDA möjliggör snabb DNA-amplifiering utan behov av PCR. Metoden är baserad på användningen av fagpolymeras phi29 , som kännetecknas av ökad processivitet (den kan syntetisera regioner över 10 kilobaser långa utan dissociation) och låg felfrekvens (1 per 10 6–10 7 baspar ) . Reaktionen fortskrider enligt följande: hexamera primers hybridiseras på matrisen, förlängs av polymeras; när enzymet möter en annan primer (som också förlängs) tränger (ersätter) den den och fortsätter på sin väg genom mallen. Den ersatta nysyntetiserade platsen fungerar som en landningsplats för nya primers och blir en mall. Således bildas ett grenat träd, där syntes sker på varje gren. I slutet av proceduren inhiberas polymeraset, nukleas S1 tillsätts för att klyva grenar vid förgreningsställena och DNA-polymeras I för att fullborda de resulterande enkelsträngade sektionerna [15] .

Metoden har ett antal problem såsom allelförlust , preferentiell amplifiering och interaktioner mellan primrar. Det första problemet uppstår från slumpmässig amplifiering av endast en av allelerna i heterozygoter , vilket resulterar i att heterozygoter felaktigt identifieras som homozygoter . På grund av den höga frekvensen av denna effekt (0-60%), minskar noggrannheten för genotypning . Det andra problemet är överamplifieringen av en allel framför andra. Interaktioner mellan hexamerprimrar sker på grund av sekvensernas slumpmässiga natur; de kan reduceras avsevärt genom att införa restriktioner på syntesen av dessa primrar [15] .

MALBACS

MALBAC är en hybrid linjär helgenomamplifieringsmetod. Metoden är baserad på speciella primrar: de är 35 nukleotider långa , varav 27 är lika i alla primrar (GTG AGT GAT GGT TGA GGT AGT GTG GAG), och de återstående 8 nukleotiderna varierar. Hela amplifieringsprocessen beskrivs enligt följande [9] :

  1. Smältning (94 °C) av dubbelsträngat DNA med bildning av enkelsträngade fragment.
  2. Kylning (0 °C), tillsats av primers och polymeras.
  3. Glödgningsprimrar på slumpmässiga ställen på mallen. Bst DNA-polymeras förlänger primrar för att bilda en halv-amplikon vid 64°C. Alla motprimrar förskjuts från mallen.
  4. Smältning (94 °C), separation av semi-amplikonen från matrisen.
  5. Kylning (0 °C), tillsats av primers och polymeras. Primerna binder effektivt till både mallen och semi-amplikonen.
  6. Bst DNA-polymeras förlänger primrar vid 64°C. Semi-amplikoner syntetiseras på den initiala matrisen, hela amplikoner syntetiseras på semi-amplikoner som erhållits tidigare .
  7. Smältning (94°C).
  8. Looping (58°C): 3'- och 5'-ändarna av de fulla amplikonerna är komplementära till varandra och bildar en slinga, vilket förhindrar användningen av hela amplikonen som mall.
  9. Upprepa steg 5-8 fem gånger.
  10. PCR med 27 vanliga nukleotider som primrar för att amplifiera endast kompletta amplikoner [9] .

Fördelen med metoden är minskningen av bruset som är förknippat med den exponentiella karaktären av PCR-amplifiering på grund av införandet av preliminär kvasi-linjär amplifiering. Detta gjorde det möjligt att öka täckningen av genomet (andelen av genomet som täcks av minst en läsning), för att minska sannolikheten för förlust av alleler och singelnukleotidpolymorfismer (SNP). Dessutom krävs en mycket liten mängd initialt DNA för inträde, men eventuell kontaminering av proverna kan avsevärt påverka resultaten av sekvensering [9] .

Nackdelen är att för att bli av med falskt positiva resultat är det nödvändigt att jämföra resultaten av sekvensering av 2–3 celler från både samma och olika cellinjer [9] . I det här fallet kan vissa polymorfismer gå förlorade, eftersom celler som tillhör samma cellinje fortfarande har vissa skillnader i genomet. Dessutom har det använda bst-DNA-polymeraset en hög felfrekvens (1 av 10 5 baser) [16] .

Jämförelse av helgenomamplifieringsmetoder

Nyligen har det gjorts flera studier som jämför dessa metoder [17] [18] [19] . En studie drog slutsatsen att MDA ger större täckning än MALBAC (84 % respektive 52 %), vilket möjliggör mer exakt detektion av singelnukleotidpolymorfismer [17] . MALBAC ger dock mer enhetlig täckning och tillåter därför mer exakt detektering av kopienummervariationer (CNV) [17] . Intressant nog, vid sekvensering av vissa celler, var nivån av detektering av kopieantalvariationer med MDA-metoden jämförbar med den för MALBAC [17] . Andra författare bekräftar också skillnaden i täckning mellan MDA och MALBAC (84% och 72%) och den jämförelsevis högre likformigheten av MALBAC-täckning ( variationskoefficient 0,10 mot 0,21 för MDA) [18] . MDA har visat sig ge färre falskt positiva, men antalet falskt negativa varierar från experiment till experiment [18] . MALBAC ger en lägre allelförlustfrekvens (21%), men dess täckning är mindre än MDA [18] . I allmänhet är det inte klart vilken som leder till färre falsknegativa, eftersom MDA täcker mer av genomet, men förlorar fler alleler på grund av den preferentiella amplifieringen av endast en av allelerna i heterozygoten [15] [18] .

Således har MDA och MALBAC en uppsättning fördelar och nackdelar, och valet bör bero på den aktuella uppgiften.

Skapa ett bibliotek

Efter amplifiering kan bibliotek framställas med användning av kommersiella kit. Flera alternativ är möjliga här: valet av ett specifikt lokus , valet av ett exom eller hela genomet för ytterligare sekvensering. Vart och ett av dessa alternativ antar vissa värden för täckning, felbenägenhet och kostnad [20] . Urvalet av små områden gör att du kan fokusera på områden som ger det största biologiska bidraget till arbetet i det studerade systemet. Detta minskar kostnaderna för forskning och sannolikheten för att introduktion av fel vid beredningen av prover. Användningen av referensgenomet reducerar falskt positiva resultat, även om det begränsar de detekterade enkelnukleotidpolymorfismerna till de som finns i referensgenomet. Exome-sekvensering gör det möjligt att isolera de unika egenskaperna hos celler, men med en ökning av längden på den sekvenserade regionen ökar sannolikheten för att införa fel under amplifiering. Användningen av hela genomet gör det möjligt att identifiera icke-kodande och strukturella regioner, men kostnaden för forskning ökar dramatiskt, vilket gör det svårt att utföra helgenomsekvensering av många celler [20] .

DNA från bibliotek skapade på ett eller annat sätt används vid sekvensering med någon av de befintliga metoderna .

Databehandling

Vanliga misstag

De flesta sekvenseringsartefakter uppstår under provberedningen: cellisolering, genomisk DNA-kontamination, amplifiering och biblioteksgenerering, eftersom alla dessa steg introducerar ytterligare fel, förlust av täckning, minskning av täckningshomogenitet, provtagningsbias i preferensval av vissa grupper av celler och amplifiering av vissa DNA-sekvenser är orsaken till förlusten av alleler i heterozygota positioner. Cellinjer bör också beaktas, på vilka optimering av alla stadier av sekvensering utförs: inte alla celler är diploida , det finns både haploida och aneuploida populationer, och deras ploiditet kan avsevärt påverka experimentet [4] . Ett hinder för att jämföra olika resultat på detta område är ibland bristen på information om det totala antalet utvärderade celler och måttet på sekvenseringskvalitetsbedömning i specifika studier [20] .

Enkelnukleotidpolymorfismer

Enkelnukleotidpolymorfismer, enligt 1000 genom-projektet , ger den största mångfalden till det mänskliga genomet [21] : 38 miljoner enkelnukleotidpolymorfier, 1,4 miljoner insertioner / deletioner och mer än 14 tusen stora deletioner [21] bekräftades på haplotypkartan . Det antas också att många komplexa sjukdomar, såsom Alzheimers sjukdom [22] , olika typer av cancer [23] , autoimmuna sjukdomar [24] kan associeras just med närvaron av polymorfismer.

Idag bygger sökningen efter polymorfismer i encellssekvenseringsdata på samma algoritmer som analysen av konventionella sekvenseringsresultat: GATK [25] , SNPdetector [26] , SOAPsnp [27] , VarScan [28] . Det finns dock skillnader mellan cellpopulationssekvensering och encellssekvensering: den senare har mindre genomtäckning och en högre falsk positiv frekvens.

Variation i antal kopior av DNA-segment

Variationer i antalet kopior av DNA-fragment leder till ett onormalt antal kopior av dessa fragment; mångfalden av denna typ av genetisk polymorfism påverkar också människors hälsa [29] [30] . Vissa studier betonar deras samband med utvecklingen av tumörer [31] , autoimmuna sjukdomar [24] , autism [32] etc. Här, liksom i sökandet efter enstaka nukleotidpolymorfismer, används i princip samma algoritmer som för konventionell sekvensering: CNV -seq [33] , PenCNV [34] , CNAseg [35] , ReadDepth [36] och cn.MOPS [37] . För att ta hänsyn till det introducerade bruset är det nödvändigt att analysera effekten av amplifieringsmetoder på uppkomsten och försvinnandet av variationer i DNA-kopiatal [38] .

Jämförande analys av celler

En strategi för cellkluster baserat på genomisk data är införandet av en distansfunktion som kvantifierar skillnader mellan par av prover [39] . I det här fallet anses Jaccard-måttet vara det lämpligaste på grund av de genetiska datas binära karaktär (se nedan) [40] . Ett alternativ till avståndsfunktionsbaserade metoder är modellbaserad klustring , som utgår från ett probabilistiskt tillvägagångssätt: istället för "hårda" avstånd, introduceras "mjuka" sannolikheter för ursprung för celler från olika kloner.

Efter att ha presenterat data för encellssekvensering som en matris , där mutationer av intresse är markerade vertikalt och celler är markerade horisontellt, fyller vi den med 0 och 1 beroende på närvaron av en viss mutation i en viss cell. Om en tumör undersöks kännetecknas den över tiden av expansionen av vissa kloner och försvinnandet av andra [41] . Samtidigt vet vi inte hur många av vilka kloner som finns, och vi antar att en del av datan gick förlorad under provberedningen.

Modellparametrar, såsom sannolikheten för att en cell kommer ned från en viss klon, såväl som den falska negativa frekvensen, kan uppskattas med hjälp av en algoritm för förväntningsmaximering [42] . Sedan reduceras problemet med att bestämma antalet kloner till valet av en statistisk modell som bäst beskriver sekvenseringsdata; utvärderingen utförs med hjälp av Bayes och Akaikes informationskriterier [43] . Det finns också ett hybridtillvägagångssätt som tillåter initial klustring med hjälp av en distansfunktion, vilket ökar hastigheten för modellbaserad klustring, vilket kräver stor beräkningskraft [44] . Baserat på resultaten av klustring byggs en profil av konsensus klonala mutationer [45] . Enligt den, med hjälp av olika metoder för att konstruera träd , är det möjligt att identifiera förhållandet mellan olika kloner. Till exempel är det möjligt att visa en tumörs evolutionära historia [45] .

Prestationer

Klonal utveckling av bröstcancerceller

Analys av mutationsmönster (insertioner, deletioner, enstaka nukleotidsubstitutioner, variationer i antal genkopior ) av olika populationer av bröstcancerceller gjorde det möjligt att identifiera både en uppsättning mutationer som är karakteristiska för var och en av populationerna (klonala mutationer) och de som inträffade i flera celler (subklonala mutationer). Data erhölls med användning av encells exomsekvensering, verifierad genom djupsekvensering. I studien användes celler av aneuploida populationer av ERBC (ER + /PR + /Her2 - ) och TNBC (ER - /PR - /Her2 - ), som skiljer sig åt i närvaron av vissa receptorer (ER/PR/Her2) på membranet yta, såväl som normala diploida celler. Resultatet var identifieringen av signifikant fler klonala mutationer i TNBC-populationen jämfört med ERBC och normala celler. I TNBC-cellpopulationen har förekomsten av tre subpopulationer av cancerceller, identifierade av mönster av subklonala mutationer, visats. Bevis har erhållits för att TNBC har en högre mutationshastighet, och deras ackumulering kan inte bara ske på grund av fel under accelererad proliferation [4] .

Det är ännu inte klart hur exakt tumörer blir resistenta mot kemoterapi . Antingen finns det redan sällsynta resistenta celler i befolkningen, eller så sker svaret spontant efter läkemedlens verkan. Dessutom är det inte alltid klart varför mutationer ackumuleras: antingen är det en accelererad mutationshastighet, som i fallet med TNBC, eller så är det ackumulering av mutationer i normal takt, men i stort antal på grund av accelererad proliferation [4] .

Perspektiv

För närvarande är huvudproblemet närvaron av ett genomiskt DNA-amplifieringssteg som ansvarar för att introducera det största antalet artefakter. Kraven på mängden DNA vid beredningen av bibliotek minskar allt mer, och det direkta skapandet av bibliotek från isolerat DNA har redan påvisats [46] [47] . Dessutom visades det att det är möjligt att avstå från bibliotek helt och hållet genom att skicka in DNA isolerat från en cell för sekvensering [48] . Det finns också möjlighet att avslöja epigenetisk information, som att söka efter metyleringsmönster [49] [50] och fånga kromosomernas konformationstillstånd [51] . Idag opererar forskare vanligtvis på tiotals till hundratals celler, men utvecklingen av automatiserade plattformar för cellinfångning, DNA-amplifiering och biblioteksberedning kommer att avsevärt öka skalan och tillgängligheten för encellsanalys, vilket gör att större experiment kan utföras på kortare tid. [52] .

Användningen av encells-DNA-sekvensering, tillsammans med epigenomiska och transkriptomstudier, kommer att göra det möjligt att korrekt klassificera celler och komplettera den befintliga synen på cellpopulationer. Det kommer också att bli möjligt att etablera relationer mellan genomsekvensen, epigenetisk status och genuttryck, och att bestämma cellernas funktionalitet [52] .

Se även

Anteckningar

  1. ↑ Tringe SG , von Mering C. , Kobayashi A. , Salamov AA , Chen K. , Chang HW , Podar M. , Short JM , Mathur EJ , Detter JC , Bork P. , Hugenholtz P. , Rubin EM Comparative metagenomics of microbial samhällen.  (engelska)  // Science (New York, NY). - 2005. - Vol. 308, nr. 5721 . - s. 554-557. - doi : 10.1126/science.1107851 . — PMID 15845853 .
  2. ↑ Marcy Y. , Ouverney C. , Bik EM , Lösekann T. , Ivanova N. , Martin HG , Szeto E. , Platt D. , Hugenholtz P. , Relman DA , Quake SR Dissekering av biologisk "mörk materia" med encellig genetisk analys av sällsynta och oodlade TM7-mikrober från människans mun.  (engelska)  // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2007. - Vol. 104, nr. 29 . - P. 11889-11894. - doi : 10.1073/pnas.0704662104 . — PMID 17620602 .
  3. ↑ McConnell MJ , Lindberg MR , Brennand KJ , Piper JC , Voet T. , Cowing-Zitron C. , Shumilina S. , Lasken RS , Vermeesch JR , Hall IM , Gage FH Mosaic copy number variation in human neurons.  (engelska)  // Science (New York, NY). - 2013. - Vol. 342, nr. 6158 . - s. 632-637. - doi : 10.1126/science.1243472 . — PMID 24179226 .
  4. ↑ 1 2 3 4 Wang Y. , Waters J. , Leung ML , Unruh A. , Roh W. , Shi X. , Chen K. , Scheet P. , Vattathil S. , Liang H. , Multani A. , Zhang H. . , Zhao R. , Michor F. , Meric-Bernstam F. , Navin NE . Klonal evolution i bröstcancer avslöjad genom sekvensering av enstaka kärngenom.  (engelska)  // Nature. - 2014. - Vol. 512, nr. 7513 . - S. 155-160. - doi : 10.1038/nature13600 . — PMID 25079324 .
  5. ↑ Wen L. , Tang F. Enkelcellssekvensering i stamcellsbiologi.  (engelska)  // Genombiologi. - 2016. - Vol. 17, nr. 1 . - P. 71. - doi : 10.1186/s13059-016-0941-0 . — PMID 27083874 .
  6. ↑ Bacher R. , Kendziorski C. Design och beräkningsanalys av encelliga RNA-sekvenseringsexperiment.  (engelska)  // Genombiologi. - 2016. - Vol. 17, nr. 1 . - P. 63. - doi : 10.1186/s13059-016-0927-y . — PMID 27052890 .
  7. ↑ Emmert-Buck MR , Bonner RF , Smith PD , Chuaqui RF , Zhuang Z. , Goldstein SR , Weiss RA , Liotta LA Mikrodissektion med laserinfångning.  (engelska)  // Science (New York, NY). - 1996. - Vol. 274, nr. 5289 . - P. 998-1001. — PMID 8875945 .
  8. ↑ HAM RG KLONAL TILLVÄXT AV Däggdjursceller I ETT KEMISKT DEFINIERAT, SYNTETISKT MEDIUM.  (engelska)  // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1965. - Vol. 53. - s. 288-293. — PMID 14294058 .
  9. ↑ 1 2 3 4 5 Zong C. , Lu S. , Chapman AR , Xie XS Genomomfattande detektion av enkelnukleotid- och kopienummervariationer av en enda mänsklig cell.  (engelska)  // Science (New York, NY). - 2012. - Vol. 338, nr. 6114 . - P. 1622-1626. - doi : 10.1126/science.1229164 . — PMID 23258894 .
  10. ↑ Gole J. , Gore A. , Richards A. , Chiu YJ , Fung HL , Bushman D. , Chiang HI , Chun J. , Lo YH , Zhang K. Massivt parallell polymeraskloning och genomsekvensering av enstaka celler med användning av nanolitermikrobrunnar.  (engelska)  // Nature biotechnology. - 2013. - Vol. 31, nr. 12 . - s. 1126-1132. - doi : 10.1038/nbt.2720 . — PMID 24213699 .
  11. ↑ White AK , VanInsberghe M. , Petriv OI , Hamidi M. , Sikorski D. , Marra MA , Piret J. , Aparicio S. , Hansen CL High-throughput microfluidic single-cell RT-qPCR.  (engelska)  // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2011. - Vol. 108, nr. 34 . - P. 13999-14004. - doi : 10.1073/pnas.1019446108 . — PMID 21808033 .
  12. ↑ Macosko EZ , Basu A. , Satija R. , Nemesh J. , Shekhar K. , Goldman M. , Tirosh I. , Bialas AR , Kamitaki N. , Martersteck EM , Trombetta JJ , Weitz DA , Sanes JR , Shalek AK , Regev A. , McCarroll SA Mycket parallell genom-wide expressionsprofilering av individuella celler med användning av nanoliterdroppar.  (engelska)  // Cell. - 2015. - Vol. 161, nr. 5 . - P. 1202-1214. - doi : 10.1016/j.cell.2015.05.002 . — PMID 26000488 .
  13. ↑ Thompson AM , Paguirigan AL , Kreutz JE , Radich JP , Chiu DT Microfluidics for single-cell genetisk analys.  (engelska)  // Lab on a chip. - 2014. - Vol. 14, nr. 17 . - s. 3135-3142. - doi : 10.1039/c4lc00175c . — PMID 24789374 .
  14. ↑ Actis P. , Maalouf MM , Kim HJ , Lohith A. , Vilozny B. , Seger RA , Pourmand N. Compartmental genomics in living cells avslöjad genom enkelcellig nanobiopsi.  (engelska)  // ACS nano. - 2014. - Vol. 8, nr. 1 . - s. 546-553. doi : 10.1021 / nn405097u . — PMID 24279711 .
  15. ↑ 1 2 3 4 Paez JG , Lin M. , Beroukhim R. , Lee JC , Zhao X. , Richter DJ , Gabriel S. , Herman P. , Sasaki H. , Altshuler D. , Li C. , Meyerson M. , Sellers WR Genomtäckning och sekvenstrohet för phi29-polymerasbaserad multipelsträngsförskjutning av hela genomförstärkningen.  (engelska)  // Nukleinsyraforskning. - 2004. - Vol. 32, nr. 9 . — P. e71. - doi : 10.1093/nar/gnh069 . — PMID 15150323 .
  16. ↑ Ausubel, FM et al. Vol. I., John Wiley & Songs, Inc. AKTUELLA PROTOKOLL INOM MOLEKYLÄRBIOLOGI. — 1995.
  17. ↑ 1 2 3 4 Hou Y. , Wu K. , Shi X. , Li F. , Song L. , Wu H. , Dean M. , Li G. , Tsang S. , Jiang R. , Zhang X. , Li B. , Liu G. , Bedekar N. , Lu N. , Xie G. , Liang H. , Chang L. , Wang T. , Chen J. , Li Y. , Zhang X. , Yang H. , Xu X. , Wang L. , Wang J. Jämförelse av variationsdetektering mellan hel-genomförstärkningsmetoder som används vid encellsresekvensering.  (engelska)  // GigaScience. - 2015. - Vol. 4. - P. 37. - doi : 10.1186/s13742-015-0068-3 . — PMID 26251698 .
  18. ↑ 1 2 3 4 5 Huang L. , Ma F. , Chapman A. , Lu S. , Xie XS Encellig helgenomförstärkning och sekvensering: metodik och tillämpningar.  (engelska)  // Årlig översyn av genomik och mänsklig genetik. - 2015. - Vol. 16. - S. 79-102. - doi : 10.1146/annurev-genom-090413-025352 . — PMID 26077818 .
  19. ↑ Chen M. , Song P. , Zou D. , Hu X. , Zhao S. , Gao S. , Ling F. Jämförelse av multipelförskjutningsförstärkning (MDA) och multipla glödgnings- och looping-baserade amplifieringscykler (MALBAC) i singel -cellsekvensering.  (engelska)  // Public Library of Science ONE. - 2014. - Vol. 9, nr. 12 . - P. e114520. - doi : 10.1371/journal.pone.0114520 . — PMID 25485707 .
  20. ↑ 1 2 3 Gawad C. , Koh W. , Quake SR Encellig genomsekvensering: vetenskapens nuvarande tillstånd.  (engelska)  // Naturrecensioner. genetik. - 2016. - Vol. 17, nr. 3 . - S. 175-188. - doi : 10.1038/nrg.2015.16 . — PMID 26806412 .
  21. ↑ 1 2 Abecasis GR , Auton A. , Brooks LD , DePristo MA , Durbin RM , Handsaker RE , Kang HM , Marth GT , McVean GA En integrerad karta över genetisk variation från 1 092 mänskliga genom.  (engelska)  // Nature. - 2012. - Vol. 491, nr. 7422 . - S. 56-65. - doi : 10.1038/nature11632 . — PMID 23128226 .
  22. ↑ Martin ER , Lai EH , Gilbert JR , Rogala AR , Afshari AJ , Riley J. , Finch KL , Stevens JF , Livak KJ , Slotterbeck BD , Slifer SH , Warren LL , Conneally PM , Schmechel DE,, Puricavis I - k . Vance MA , Roses AD , Vance JM SNP-borttagning av komplexa sjukdomar: analys av enkelnukleotidpolymorfismer kring APOE vid Alzheimers sjukdom.  (engelska)  // American journal of human genetics. - 2000. - Vol. 67, nr. 2 . - s. 383-394. - doi : 10.1086/303003 . — PMID 10869235 .
  23. ↑ Zhu Y. , Spitz MR , Lei L. , Mills GB , Wu X. En enkel nukleotidpolymorfism i matrismetalloproteinas-1-promotorn ökar lungcancerkänsligheten.  (engelska)  // Cancerforskning. - 2001. - Vol. 61, nr. 21 . - P. 7825-7829. — PMID 11691799 .
  24. ↑ 1 2 Schaschl H. , Aitman TJ , Vyse TJ Kopieringsnummervariation i det mänskliga genomet och dess implikation i autoimmunitet.  (engelska)  // Klinisk och experimentell immunologi. - 2009. - Vol. 156, nr. 1 . - S. 12-16. - doi : 10.1111/j.1365-2249.2008.03865.x . — PMID 19220326 .
  25. ↑ McKenna A. , Hanna M. , Banks E. , Sivachenko A. , Cibulskis K. , Kernytsky A. , Garimella K. , Altshuler D. , Gabriel S. , Daly M. , DePristo MA The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce ram för analys av nästa generations DNA-sekvenseringsdata.  (engelska)  // Genomforskning. - 2010. - Vol. 20, nej. 9 . - P. 1297-1303. - doi : 10.1101/gr.107524.110 . — PMID 20644199 .
  26. ↑ Zhang J. , Wheeler DA , Yakub I. , Wei S. , Sood R. , Rowe W. , Liu PP , Gibbs RA , Buetow KH SNP- detektor: ett mjukvaruverktyg för känslig och exakt SNP-detektering.  (engelska)  // Public Library of Science for Computational Biology. - 2005. - Vol. 1, nr. 5 . - P. e53. - doi : 10.1371/journal.pcbi.0010053 . — PMID 16261194 .
  27. ↑ Li R. , Li Y. , Fang X. , Yang H. , Wang J. , Kristiansen K. , Wang J. SNP-detektion för massivt parallell helgenomåtersekvensering.  (engelska)  // Genomforskning. - 2009. - Vol. 19, nr. 6 . - s. 1124-1132. - doi : 10.1101/gr.088013.108 . — PMID 19420381 .
  28. ↑ Koboldt DC , Chen K. , Wylie T. , Larson DE , McLellan MD , Mardis ER , Weinstock GM , Wilson RK , Ding L. VarScan: variantdetektering i massivt parallell sekvensering av individuella och poolade prover.  (engelska)  // Bioinformatik. - 2009. - Vol. 25, nr. 17 . - s. 2283-2285. - doi : 10.1093/bioinformatics/btp373 . — PMID 19542151 .
  29. ↑ Redon R. , Ishikawa S. , Fitch KR , Feuk L. , Perry GH , Andrews TD , Fiegler H. , Shapero MH , Carson AR , Chen W. , Cho EK , Dallaire S. , Freeman JL , González JR , Gratacòs M. , Huang J. , Kalaitzopoulos D. , Komura D. , MacDonald JR , Marshall CR , Mei R. , Montgomery L. , Nishimura K. , Okamura K. , Shen F. , Somerville MJ , Tchinda J. , Valsesia A. . , Woodwark C. , Yang F. , Zhang J. , Zerjal T. , Zhang J. , Armengol L. , Conrad DF , Estivill X. , Tyler-Smith C. , Carter NP , Aburatani H. , Lee C. , Jones KW , Scherer SW , Hurles ME Global variation i antal kopior i det mänskliga genomet.  (engelska)  // Nature. - 2006. - Vol. 444, nr. 7118 . - S. 444-454. - doi : 10.1038/nature05329 . — PMID 17122850 .
  30. ↑ Zhang F. , Gu W. , Hurles ME , Lupski JR Kopieringsnummervariation i människors hälsa, sjukdom och evolution.  (engelska)  // Årlig översyn av genomik och mänsklig genetik. - 2009. - Vol. 10. - s. 451-481. - doi : 10.1146/annurev.genom.9.081307.164217 . — PMID 19715442 .
  31. ↑ Frank B. , Bermejo JL , Hemminki K. , Sutter C. , Wappenschmidt B. , Meindl A. , Kiechle-Bahat M. , Bugert P. , Schmutzler RK , Bartram CR , Burwinkel B. Kopieringsnummervariant i tumörkandidaten suppressorgenen MTUS1 och familjebröstcancerrisk.  (engelska)  // Carcinogenes. - 2007. - Vol. 28, nr. 7 . - P. 1442-1445. - doi : 10.1093/carcin/bgm033 . — PMID 17301065 .
  32. ↑ Glessner JT , Wang K. , Cai G. , Korvatska O. , Kim CE , Wood S. , Zhang H. , Estes A. , Brune CW , Bradfield JP , Imielinski M. , Frackelton EC , Reichert J. , Crawford EL , Munson J. , Sleiman PM , Chiavacci R. , Annaiah K. , Thomas K. , Hou C. , Glaberson W. , Flory J. , Otieno F. , Garris M. , Soorya L. , Klei L. , Piven J. . , Meyer KJ , Anagnostou E. , Sakurai T. , Game RM , Rudd DS , Zurawiecki D. , McDougle CJ , Davis LK , Miller J. , Posey DJ , Michaels S. , Kolevzon A. , Silverman JM , Bernier R. , Levy SE , Schultz RT , Dawson G. , Owley T. , McMahon WM , Wassink TH , Sweeney JA , Nurnberger JI , Coon H. , Sutcliffe JS , Minshew NJ , Grant SF , Bucan M. , Cook EH , B , Devlin B. , Schellenberg GD , Hakonarson H. Autism genomomfattande kopia antal variation avslöjar ubiquitin och neuronala gener.  (engelska)  // Nature. - 2009. - Vol. 459, nr. 7246 . - s. 569-573. - doi : 10.1038/nature07953 . — PMID 19404257 .
  33. ↑ Xie C. , Tammi MT CNV-seq, en ny metod för att upptäcka kopietalsvariation med hjälp av högkapacitetssekvensering.  (engelska)  // BMC bioinformatics. - 2009. - Vol. 10. - P. 80. - doi : 10.1186/1471-2105-10-80 . — PMID 19267900 .
  34. ↑ Wang K. , Li M. , Hadley D. , Liu R. , Glessner J. , Grant SF , Hakonarson H. , Bucan M. PennCNV: en integrerad dold Markov-modell utformad för att upptäcka högupplöst kopienummervariation i hel- genom SNP-genotypningsdata.  (engelska)  // Genomforskning. - 2007. - Vol. 17, nr. 11 . - P. 1665-1674. - doi : 10.1101/gr.6861907 . — PMID 17921354 .
  35. ↑ Ivakhno S. , Royce T. , Cox AJ , Evers DJ , Cheetham RK , Tavaré S. CNAseg--ett nytt ramverk för identifiering av kopienummerförändringar i cancer från andra generationens sekvenseringsdata.  (engelska)  // Bioinformatik. - 2010. - Vol. 26, nr. 24 . - P. 3051-3058. - doi : 10.1093/bioinformatics/btq587 . — PMID 20966003 .
  36. ↑ Miller CA , Hampton O. , Coarfa C. , Milosavljevic A. ReadDepth: ett parallellt R-paket för att detektera kopienummerändringar från korta sekvensläsningar.  (engelska)  // Public Library of Science ONE. - 2011. - Vol. 6, nr. 1 . - P. e16327. - doi : 10.1371/journal.pone.0016327 . — PMID 21305028 .
  37. ↑ Klambauer G. , Schwarzbauer K. , Mayr A. , Clevert DA , Mitterecker A. , Bodenhofer U. , Hochreiter S. cn.MOPS: blandning av Poissons för att upptäcka kopienummervariationer i nästa generations sekvenseringsdata med låg falsk upptäckt Betygsätta.  (engelska)  // Nukleinsyraforskning. - 2012. - Vol. 40, nej. 9 . — P. e69. - doi : 10.1093/nar/gks003 . — PMID 22302147 .
  38. ↑ Ning L. , Liu G. , Li G. , Hou Y. , Tong Y. , He J. Aktuella utmaningar i bioinformatiken för enkelcellsgenomik.  (engelska)  // Frontiers in oncology. - 2014. - Vol. 4. - P. 7. - doi : 10.3389/fonc.2014.00007 . — PMID 24478987 .
  39. ↑ Eisen MB , Spellman PT , Brown PO , Botstein D. Klusteranalys och visning av genomomfattande uttrycksmönster.  (engelska)  // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1998. - Vol. 95, nr. 25 . - P. 14863-14868. — PMID 9843981 .
  40. ↑ Prokopenko D. , Hecker J. , Silverman EK , Pagano M. , Nöthen MM , Dina C. , Lange C. , Fier HL Användning av Jaccard-index för att avslöja befolkningsstratifiering i sekvenseringsdata: en simuleringsstudie och en applikation till 1000 Genomprojekt.  (engelska)  // Bioinformatik. - 2016. - Vol. 32, nr. 9 . - P. 1366-1372. - doi : 10.1093/bioinformatics/btv752 . — PMID 26722118 .
  41. ↑ Greaves M. , Maley C. C. Clonal evolution in cancer.  (engelska)  // Nature. - 2012. - Vol. 481, nr. 7381 . - s. 306-313. - doi : 10.1038/nature10762 . — PMID 22258609 .
  42. ↑ A.P. Dempster; NM Laird; D.B. Rubin. Maximal sannolikhet från ofullständig data via EM-algoritmen  // Journal of the Royal Statistical Society. Serie B (metodologisk). - 1977. - Vol. 39, nr 1 . - S. 1-38. - doi : 10.2307/2984875 . Arkiverad från originalet den 11 december 2015.
  43. ↑ C. Fraley, A. E. Raftery. Hur många kluster? Vilken klustringsmetod?  Svar via modellbaserad klusteranalys . - 1998. - doi : 10.1093/comjnl/41.8.578 . Arkiverad från originalet den 22 februari 2017.
  44. ↑ Chris Fraley, Adrian E. Raftery. MCLUST: Programvara för modellbaserad klusteranalys  (engelska)  // Journal of Classification. - 1999. - doi : 10.1007/s003579900058 . Arkiverad från originalet den 22 juli 2017.
  45. ↑ 1 2 Kim KI , Simon R. Använda encellssekvenseringsdata för att modellera en tumörs evolutionära historia.  (engelska)  // BMC bioinformatics. - 2014. - Vol. 15. - P. 27. - doi : 10.1186/1471-2105-15-27 . — PMID 24460695 .
  46. ↑ Falconer E. , Hills M. , Naumann U. , Poon SS , Chavez EA , Sanders AD , Zhao Y. , Hirst M. , Lansdorp PM DNA-mallsträngssekvensering av singelceller kartlägger genomiska omarrangemang vid hög upplösning.  (engelska)  // Nature methods. - 2012. - Vol. 9, nr. 11 . - P. 1107-1112. - doi : 10.1038/nmeth.2206 . — PMID 23042453 .
  47. ↑ Falconer E. , Lansdorp PM Strand-seq: ett förenande verktyg för studier av kromosomsegregering.  (engelska)  // Seminarier i cell- och utvecklingsbiologi. - 2013. - Vol. 24, nr. 8-9 . - s. 643-652. - doi : 10.1016/j.semcdb.2013.04.005 . — PMID 23665005 .
  48. ↑ Coupland P. , Chandra T. , Quail M. , Reik W. , Swerdlow H. Direkt sekvensering av små genom på Pacific Biosciences RS utan biblioteksförberedelser.  (engelska)  // BioTechniques. - 2012. - Vol. 53, nr. 6 . - s. 365-372. - doi : 10.2144/000113962 . — PMID 23227987 .
  49. ↑ El Hajj N. , Trapphoff T. , Linke M. , May A. , Hansmann T. , Kuhtz J. , Reifenberg K. , Heinzmann J. , Niemann H. , Daser A. , Eichenlaub-Ritter U. , Zechner U. . , Haaf T. Begränsande utspädningsbisulfit (pyro)-sekvensering avslöjar föräldraspecifika metyleringsmönster i enstaka tidiga musembryon och bovina oocyter.  (engelska)  // Epigenetik. - 2011. - Vol. 6, nr. 10 . - P. 1176-1188. - doi : 10.4161/epi.6.10.17202 . — PMID 21937882 .
  50. ↑ Guo H. , Zhu P. , Wu X. , Li X. , Wen L. , Tang F. Encelliga metylomlandskap av embryonala musembryonala stamceller och tidiga embryon analyserade med hjälp av reducerad representationsbisulfitsekvensering.  (engelska)  // Genomforskning. - 2013. - Vol. 23, nr. 12 . - P. 2126-2135. - doi : 10.1101/gr.161679.113 . — PMID 24179143 .
  51. ↑ Nagano T. , Lubling Y. , Yaffe E. , Wingett SW , Dean W. , Tanay A. , Fraser P. Single-cell Hi-C för genomomfattande detektion av kromatininteraktioner som sker samtidigt i en enda cell.  (engelska)  // Nature protocols. - 2015. - Vol. 10, nr. 12 . - P. 1986-2003. - doi : 10.1038/nprot.2015.127 . — PMID 26540590 .
  52. ↑ 1 2 Macaulay IC , Voet T. Enkelcellsgenomik: framsteg och framtidsperspektiv.  (engelska)  // PLoS genetik. - 2014. - Vol. 10, nr. 1 . — P. e1004126. - doi : 10.1371/journal.pgen.1004126 . — PMID 24497842 .