Inom biologi är det aktiva stället det område av ett enzym där substratmolekyler binder och genomgår en kemisk reaktion . Det aktiva stället består av aminosyrarester som bildar övergående bindningar med substratet ( bindningsställe ) och rester som katalyserar reaktionen av det substratet (katalytiskt ställe). Även om det aktiva stället bara upptar ~10-20% av volymen av enzymet [1] :19 är det den viktigaste delen eftersom den direkt katalyserar den kemiska reaktionen . Vanligtvis består det aktiva stället av tre till fyra aminosyror , medan andra aminosyror i ett protein är nödvändiga för att bibehålla dess tertiära struktur [2] .
Varje aktiv plats har utvecklats för att optimera bindningen till ett specifikt substrat och katalysera en specifik reaktion, vilket resulterar i hög enzymspecificitet. Denna specificitet bestäms av arrangemanget av aminosyror i det aktiva stället och strukturen av substraten. Ibland behöver enzymer också binda till vissa kofaktorer för att kunna utföra sin funktion. Den aktiva platsen är vanligtvis ett spår eller ficka i enzymet, som kan vara lokaliserat i en djup tunnel inom enzymet [3] eller vid gränssnittsgränser i multimera enzymer . Det aktiva stället kan återkatalysera reaktionen eftersom dess aminosyrarester inte förändras i slutet av reaktionen (de kan förändras under reaktionen, men regenereras mot slutet) [4] . Denna process uppnås genom att sänka reaktionens aktiveringsenergi , så att fler substrat har tillräckligt med energi för att utföra reaktionen.
Vanligtvis har en enzymmolekyl endast två aktiva ställen, och dessa aktiva ställen motsvarar en speciell typ av substrat. Det aktiva stället innehåller ett bindningsställe som binder substratet och orienterar det för katalys. Orienteringen av substratet och närheten mellan det och det aktiva stället är så viktigt att ett enzym i vissa fall fortfarande kan fungera korrekt även om alla andra delar av det har muterats och förlorat sin funktion [5] .
Inledningsvis är interaktionen mellan det aktiva stället och substratet icke-kovalent och tillfällig. Det finns fyra viktiga typer av interaktioner som håller substratet i en specifik orientering och bildar ett enzym-substratkomplex (ES-komplex): vätebindningar , van der Waals-interaktioner , hydrofoba interaktioner och elektrostatiska kraftinteraktioner [6] :148 . Laddningsfördelningen på substrat och aktiv plats måste vara komplementär, vilket innebär att alla positiva och negativa laddningar måste neutraliseras. Annars kommer den frånstötande kraften att trycka isär dem. Det aktiva stället innehåller vanligtvis opolära aminosyror, även om ibland också polära aminosyror kan hittas [2] . Bindning av ett substrat till ett bindningsställe kräver minst tre kontaktpunkter för att uppnå stereo-, regio- och enantioselektivitet. Till exempel interagerar alkoholdehydrogenas, som katalyserar överföringen av hydridjonen från etanol till NAD +, med substratet metylgrupp , hydroxylgrupp och pro- (R) -väte, som kommer att avlägsnas under reaktionen [6] :149 .
För att utföra sin funktion måste enzymer anta rätt proteinveck ( native fold ) och tertiär struktur. För att upprätthålla en given tredimensionell struktur förlitar sig proteiner på olika typer av interaktioner mellan deras aminosyrarester. Om dessa interaktioner förhindras, till exempel av extrema pH-värden, hög temperatur eller höga jonkoncentrationer, kommer enzymet att denaturera och förlora sin katalytiska aktivitet.
Man tror att en tätare koppling mellan det aktiva stället och substratmolekylen ökar reaktionens effektivitet. Om tätheten mellan det aktiva stället för DNA-polymeraset och dess substrat ökar, ökar även troheten, dvs. hastigheten för korrekt DNA-replikation [7] . De flesta enzymer har djupt liggande aktiva platser som substratet endast kan komma åt genom åtkomstkanaler [3] .
Tre modeller föreslås för hur enzymer passar deras specifika substrat: lås- och nyckelmodellen, modellen för inducerad passform och den konformationella urvalsmodellen. De två sista utesluter inte varandra: konformationellt urval kan åtföljas av en förändring i enzymets form. Dessutom kanske proteinet inte helt passar någon av modellerna. Aminosyrorna vid ubiquitinbindningsstället följer i allmänhet ett inducerat passningsmönster, medan resten av proteinet i allmänhet följer ett konformationellt urvalsmönster. Faktorer som temperatur påverkar sannolikt vägen som tas under bindning, med högre temperaturer som förutspås öka vikten av konformationellt urval och minska vikten av inducerad passform [8] .
Konceptet föreslogs av 1800-talets kemist Emil Fischer . Han föreslog att den aktiva platsen och substratet är två stabila strukturer som passar perfekt utan någon ytterligare modifiering, precis som en nyckel sätts in i ett lås. Om ett substrat perfekt binder till sitt aktiva ställe, kommer interaktionerna mellan dem att vara starkast, vilket resulterar i hög katalytisk effektivitet.
Med tiden började begränsningarna för denna modell att visa sig. Till exempel kan den kompetitiva hämmaren av enzymet metylglukosid binda tätt till det aktiva stället för 4-alfa-glukanotransferas och passa perfekt in i det. Emellertid är 4-alfa-glukanotransferas inte aktivt på metylglukosid och glykosylöverföring sker inte. Lås- och nyckelhypotesen kan inte förklara detta, eftersom den förutspår hög överföringseffektivitet för metylglukosidglykosyl på grund av dess starka bindning. Förutom kompetitiv hämning kan denna teori inte förklara verkningsmekanismen för icke-konkurrerande hämmare, eftersom de inte binder till det aktiva stället, men ändå påverkar den katalytiska aktiviteten [9] .
Daniel Koshlands teori om enzym-substratbindning är att det aktiva stället och bindningsdelen av substratet inte är helt komplementära [10] . Modellen med inducerad passform är en vidareutveckling av lås- och nyckelmodellen och antar att den aktiva platsen är flexibel och ändrar form tills substratet är helt bundet. Denna modell liknar en person som tar på sig en handske: handsken ändrar form för att passa handen. Ett enzym har initialt en konformation som attraherar dess substrat. Ytan på ett enzym är flexibel och endast rätt katalysator kan orsaka interaktionen som leder till katalys. När substratet binder kan konformationsförändringar inträffa. Efter att produkterna från reaktionen har flyttat bort från enzymet kommer det aktiva centret att återgå till sin ursprungliga form. Denna hypotes stöds av observationen att hela proteindomänen kan röra sig flera nanometer under katalys. Rörelsen av proteinytan kan skapa en mikromiljö som främjar katalys [5] .
Denna modell antyder att enzymer existerar i en mängd olika konformationer, av vilka endast några kan binda till ett substrat. När ett substrat är bundet till ett protein förskjuts jämvikten i den konformationella ensemblen mot de som kan binda ligander (eftersom enzymer med bundna substrat avlägsnas från jämvikten mellan fria konformationer) [11] .
Elektrostatisk interaktion : I en vattenhaltig miljö attraheras motsatt laddade grupper i sidokedjorna av aminosyror i det aktiva stället och substrat till varandra, vilket kallas elektrostatisk interaktion. Till exempel, när en karboxylsyra (R-COOH) dissocierar i RCOO- och H + -joner , kommer COO- att attrahera positivt laddade grupper såsom den protonerade guanidinsidokedjan av arginin .
Vätebindning : En vätebindning är en speciell typ av dipol-dipol-interaktion mellan en delvis positiv väteatom och en delvis negativ elektrondonator som innehåller ett par elektroner som syre , fluor och kväve . Styrkan hos en vätebindning beror på den kemiska naturen och geometriska arrangemanget för varje grupp.
Van der Waals- kraft: Van der Waals-kraften bildas mellan motsatt laddade grupper på grund av den tidsmässiga ojämna fördelningen av elektroner i varje grupp. Om alla elektroner är koncentrerade vid en pol av gruppen, kommer denna ände att vara negativ och den andra änden positiv. Även om gruppens individuella styrka är liten, är det totala antalet av dessa interaktioner mellan det aktiva stället och substratet stort, så deras summa kan vara betydande.
Hydrofob interaktion : Icke-polära hydrofoba grupper tenderar att aggregeras i en vattenhaltig miljö och försöker fly från ett polärt lösningsmedel. Dessa hydrofoba grupper har vanligtvis en lång kolkedja och reagerar inte med vattenmolekyler. När proteinmolekylen löses i vatten viks den till en sfärisk form och lämnar de hydrofila grupperna på utsidan, medan de hydrofoba grupperna sjunker djupt in i mitten.
Efter bindning av substratet till det aktiva stället och dess orientering kan katalys påbörjas. Aminosyraresterna i det katalytiska stället är vanligtvis mycket nära bindningsstället, och vissa rester kan spela en dubbel roll i både bindning och katalys. De interagerar med substratet för att sänka reaktionens aktiveringsenergi och därigenom påskynda dess förlopp. Minskningen av aktiveringsenergi kan ske genom en mängd olika mekanismer inklusive: närmande av reaktanter, nukleofil/elektrofil katalys och syra-baskatalys.
Under en enzymatisk katalytisk reaktion är substratet och det aktiva stället i omedelbar närhet. Detta tillvägagångssätt har olika mål. För det första, när substrat binder inom det aktiva stället, är dess effektiva koncentration mycket större än i lösning. Detta innebär att antalet substratmolekyler som är involverade i reaktionen också ökar. Denna process minskar också upplösningsenergin som krävs för att reaktionen ska fortsätta. I lösning är substratmolekyler omgivna av lösningsmedelsmolekyler, och enzymmolekyler kräver energi för att ersätta dem och komma i kontakt med substratet. Eftersom skrymmande molekyler kan uteslutas från det aktiva stället, kan denna energiutmatning minimeras. Vidare är det aktiva stället involverat i omorienteringen av substratet för att minska reaktionens aktiveringsenergi. Inriktning av substratet efter bindning blockeras i ett högenergitillstånd och kan fortsätta till nästa steg. Dessutom underlättas denna bindning av entropi, eftersom energikostnaderna förknippade med reaktionen i lösning i stort sett elimineras, eftersom lösningsmedlet inte kan komma in i det aktiva stället. Slutligen kan den aktiva platsen manipulera substratets molekylära orbital i en lämplig orientering för att sänka aktiveringsenergin [6] :155–8 .
De elektrostatiska tillstånden hos substratet och det aktiva centret måste komplettera varandra. Den polariserade negativt laddade aminosyrasidokedjan stöter bort det oladdade substratet. Men om övergångstillståndet involverar bildandet av ett joncentrum , kommer sidokedjan att producera en gynnsam interaktion.
Många enzymer, inklusive serinproteas , cysteinproteas , proteinkinas och fosfatas, har utvecklats för att bilda övergående kovalenta bindningar mellan dem och deras substrat, vilket sänker aktiveringsenergin och låter reaktionen fortsätta. Denna process kan delas in i 2 steg: bildning och förstörelse. Det första steget är det hastighetsbegränsande steget, medan nästa steg krävs för regenereringen av det intakta enzymet [6] :158 .
Nukleofil katalys
Denna process involverar överföring av elektroner från enzymets nukleofil till substratet för att bilda en kovalent bindning mellan dem under övergångstillståndet. Styrkan i denna interaktion beror på två aspekter: förmågan hos den nukleofila gruppen att donera elektroner och förmågan hos elektrofilen att acceptera dem. Den förra beror huvudsakligen på artens basicitet (förmåga att donera elektronpar) och den senare på dess pKa . Båda grupperna påverkas också av deras kemiska egenskaper såsom polariserbarhet , elektronegativitet och joniseringspotential . Aminosyror som kan bilda nukleofila reagens - serin , cystein , aspartat och glutamin .
Elektrofil katalys
Mekanismen bakom denna process är exakt densamma som nukleofil katalys, förutom nu fungerar aminosyrorna i det aktiva stället som elektrofiler och substraten fungerar som nukleofiler . Denna reaktion kräver vanligtvis kofaktorer eftersom aminosyrasidokedjor inte är tillräckligt starka för att attrahera elektroner.
Metalljoner spelar flera roller under en reaktion. För det första kan de binda till de negativt laddade grupperna på substratet, så de kommer inte att stöta bort elektronpar från de nukleofila grupperna på det aktiva stället. De kan attrahera negativt laddade elektroner för att öka elektrofilicitet. Metalljoner kan också fungera som en brygga mellan det aktiva stället och substratet. Slutligen kan de ändra konformationsstrukturen hos substratet till förmån för reaktionen [6] :158 .
I vissa reaktioner kan protoner och hydroxid agera direkt som syra och bas i specifik syra- och specifik alkalikatalys. Men oftare fungerar grupperna i substratet och det aktiva stället som en syra och en Brønsted-Lowry-bas. Detta kallas den allmänna teorin om syra och den allmänna teorin om baser. Det enklaste sättet att skilja dem åt är att se om reaktionshastigheten bestäms av koncentrationerna av den totala syran och basen. Om ja, är svaret generellt. Eftersom de flesta enzymer har ett optimalt pH på 6 till 7, har aminosyror i sidokedjan vanligtvis ett pKa på 4 ~ 10. Kandidater inkluderar aspartat , glutamat , histidin , cystein . Dessa syror och baser kan stabilisera nukleofilen eller elektrofilen som bildas under katalys, vilket ger positiva och negativa laddningar [6] :164–70 .
Kvantitativa studier av enzymatiska reaktioner har ofta funnit att accelerationen av en kemisk reaktions hastighet inte helt kan förklaras av existerande teorier som approximation, syra-baskatalys och elektrofil/nukleofil katalys. Och här uppstår en uppenbar paradox: i en reversibel enzymatisk reaktion, om det aktiva stället är idealiskt för substraten, kommer den omvända reaktionen att bromsas, eftersom produkterna inte kan passa perfekt in i det aktiva stället. Sålunda introducerades begreppet "konformationell distorsion" och det hävdas att både den aktiva platsen och substratet kan genomgå konformationsförändringar för att hela tiden anpassa sig till varandra [6] :170–5 .
Denna teori påminner något om lås- och nyckelteorin, men i den är den aktiva platsen förprogrammerad för att perfekt binda till substratet i övergångstillståndet snarare än i grundtillståndet. Bildandet av ett övergångstillstånd i lösning kräver mycket energi för att flytta lösningsmedelsmolekylerna, och reaktionen saktar ner. Således kan det aktiva stället tränga undan lösningsmedelsmolekyler och omge substrat för att minimera den kontraproduktiva effekten som orsakas av lösningen. Närvaron av laddade grupper i det aktiva stället kommer att attrahera substrat och ge elektrostatisk komplementaritet [6] :176–8 .
Faktum är att de flesta enzymatiska mekanismer involverar en kombination av flera olika typer av katalys.
Rollen för glutation (GSH) är att avlägsna ackumulerade reaktiva syreämnen som kan skada celler. Under denna process oxideras dess tiolsidokedja och två glutationmolekyler förenas med en disulfidbindning för att bilda en dimer (GSSG). För att regenerera glutation är det nödvändigt att bryta disulfidbindningen. I mänskliga celler görs detta av glutationreduktas (GR).
Glutationreduktas är en dimer som innehåller två identiska subenheter. En NADP och en FAD krävs som kofaktorer . Den aktiva platsen är i korsningen mellan två underenheter. NADPH är involverad i genereringen av FADH- . Det finns två cysteinrester i det aktiva stället utöver FAD-kofaktorn, som används för att bryta disulfidbindningen under den katalytiska reaktionen. NADPH binder till tre positivt laddade rester: Arg-218, His-219 och Arg-224.
Den katalytiska processen börjar när FAD reduceras av NADPH för att acceptera en elektron och blir FADH- . Den attackerar sedan disulfidbindningen mellan de 2 cysteinresterna och bildar en SH-bindning och en S- grupp . Denna S -grupp kommer att fungera som en nukleofil för att attackera disulfidbindningen i oxiderat glutation (GSSG), bryta den och bilda ett cystein-SG-komplex. Den första SG -anjonen frigörs och tar sedan emot en proton från den intilliggande SH-gruppen från den första glutationmonomeren. Sedan angriper den intilliggande S - gruppen disulfidbindningen i cystein-SG-komplexet och frisätter den andra SG- anjonen . Den tar emot en proton i lösning och bildar en andra glutationmonomer [1] :137–9 .
Kymotrypsin är ett serin-endopeptidas som finns i bukspottkörteljuice som hjälper till vid hydrolysen av proteiner och peptider [1] :84–6 . Det katalyserar hydrolysen av peptidbindningar i L-isomererna av tyrosin , fenylalanin och tryptofan . I det aktiva stället för detta enzym arbetar tre aminosyrarester tillsammans för att bilda en katalytisk triad som utgör det katalytiska stället. I kymotrypsin är dessa rester Ser-195, His-57 och Asp-102.
Verkningsmekanismen för chymotrypsin kan delas in i två faser. Först angriper Ser-195 nukleofilt kolet i peptidbindningen i substratet för att bilda en tetraedrisk mellanprodukt. Nukleofilicitet för Ser-195 förstärks av His-57, som abstraherar en proton från Ser-195 och stabiliseras i sin tur av den negativt laddade karboxylatgruppen (RCOO - ) i Asp-102. Dessutom stabiliseras den mellanliggande tetraedriska oxianjonen som bildas i detta skede av vätebindningar från Ser-195 och Gly-193.
I det andra steget protoneras R'NH-gruppen av His-57 för att bilda R'NH2 och lämnar en mellanprodukt, vilket lämnar det acylerade Ser-195. His-57 fungerar sedan som en bas igen för att ta bort en proton från vattenmolekylen. Den resulterande hydroxidanjonen attackerar nukleofilt acylenzymkomplexet för att bilda en andra tetraedrisk oxianjonmellanprodukt, som återigen stabiliseras av H-bindningar. Så småningom lämnar Ser-195 den tetraedriska mellanprodukten och bryter CO-bindningen som länkade enzymet till peptidsubstratet. Protonen överförs till Ser-195 via His-57 så att alla tre aminosyrorna återgår till sitt ursprungliga tillstånd.
Substratavlossningen påverkas av olika faktorer. Större ligander tenderar att stanna längre i det aktiva stället [12] liksom ligander med mer roterbara bindningar (även om detta kan vara en bieffekt av storleken) [13] . När lösningsmedlet avlägsnas från det aktiva stället förblir mindre "flexibla" proteiner på det aktiva stället längre. Ett stort antal vätebindningar avskärmade från lösningsmedlet bromsar också klyvningen [12] .
Enzymer kan använda kofaktorer som "hjälparmolekyler". Koenzymer hänvisar till de icke-proteinmolekyler som binder till enzymer för att hjälpa dem att göra sitt jobb. De är huvudsakligen kopplade till det aktiva stället genom icke-kovalenta bindningar såsom vätebindning eller hydrofob interaktion . Men ibland kan också en kovalent bindning bildas mellan dem. Till exempel är hemen i cytokrom C kopplad till ett protein via en tioeterbindning . I vissa fall kan koenzymer lämna enzymer efter sig efter att reaktionen är avslutad. Annars är de permanent associerade med enzymet [6] :69 . Koenzym är ett brett begrepp som inkluderar metalljoner, olika vitaminer och ATP . Om ett enzym behöver ett koenzym för att fungera på egen hand, kallas det ett apoenzym. I själva verket kan den inte korrekt katalysera reaktioner på egen hand. Först när dess kofaktor kommer in och binder till det aktiva stället för att bilda ett holoenzym fungerar det korrekt.
Ett exempel på ett koenzym är flavin . Den innehåller ett separat konjugerat isoalloxazinringsystem. Flavin har flera redoxtillstånd och kan användas i processer som involverar överföring av en eller två elektroner. Det kan fungera som en elektronacceptor i en reaktion som oxidation av NAD till NADH, acceptera två elektroner och bilda 1,5-dihydroflavin. Å andra sidan kan den bilda semikinon ( en fri radikal ) genom att acceptera en elektron och sedan konvertera till den helt reducerade formen genom att lägga till en extra elektron. Denna egenskap gör att den kan användas i processen med en-elektronoxidation.
Inhibitorer stör interaktionen mellan enzymet och substratet och saktar ner reaktionshastigheten. Det finns olika typer av inhibitorer, inklusive både reversibla och irreversibla former.
Konkurrerande inhibitorer är inhibitorer som endast riktar sig mot fria enzymmolekyler. De konkurrerar med substrat om en fri enzymacceptor och deras inflytande kan övervinnas genom att öka koncentrationen av substratet. De har två verkningsmekanismer. Konkurrerande inhibitorer delar vanligtvis strukturella likheter med substrat och/eller ES-komplexet. Som ett resultat kan de passa in i det aktiva stället och initiera interaktioner för att fylla enzymutrymmet och blockera inträdet av substrat. De kan också orsaka tillfälliga konformationsförändringar i det aktiva stället så att substrat inte kan passa perfekt med det. Efter en kort tidsperiod kommer kompetitiva inhibitorer att falla av och lämna enzymet intakt.
Inhibitorer klassificeras som icke-kompetitiva hämmare om de binder både det fria enzymet och ES-komplexet. Eftersom de inte konkurrerar med substrat om det aktiva stället, kan de inte övervinnas genom att helt enkelt öka koncentrationen av substratet. De binder vanligtvis till ett annat ställe på enzymet och ändrar den tredimensionella strukturen av det aktiva stället för att blockera in- eller utträde av substrat från enzymet.
Irreversibla inhibitorer liknar kompetitiva inhibitorer genom att de båda binder till det aktiva stället. Men irreversibla inhibitorer bildar irreversibla kovalenta bindningar med aminosyrarester i det aktiva stället och försvinner aldrig. Därför är den aktiva platsen upptagen och substratet kan inte penetrera. Ibland lämnar inhibitorn, men formen på det katalytiska centret förblir förändrad. Dessa inhibitorer innehåller vanligtvis elektrofila grupper som halogensubstitut och epoxider . Med tiden binds fler och fler enzymer av irreversibla inhibitorer och slutar fungera.
| Exempel | Binder det aktiva centret? | Bromsar det reaktionen? | |
|---|---|---|---|
| Konkurrenskraftig reversibel inhibitor | HIV-proteashämmare | Ja | Ja |
| Icke-konkurrenskraftig reversibel inhibitor | Tungmetaller som bly och kvicksilver | Inte | Ja |
| irreversibel inhibitor | Cyanid | Ja | Ja |
HIV-proteashämmare används för att behandla patienter infekterade med AIDS -viruset genom att förhindra dess DNA från att replikera . HIV-proteaset används av viruset för att klyva Gag-Pol-polyproteinet till 3 mindre proteiner som är ansvariga för montering, packning och mognad av virionen. Detta enzym riktar sig mot ett specifikt fenylalanin- och prolinklyvningsställe i målproteinet [14] . Om HIV-proteaset stängs av kommer virionpartikeln att förlora funktion och inte kunna infektera patienter. Eftersom det är viktigt för viral replikation och saknas hos friska individer, är det ett idealiskt mål för läkemedelsutveckling.
HIV-proteaset tillhör familjen asparaginsyraproteaser och har en liknande mekanism. Först aktiverar aspartatresten vattenmolekylen och förvandlar den till en nukleofil . Den attackerar sedan karbonylgruppen i peptidbindningen (NH-CO) för att bilda en tetraedrisk mellanprodukt. Kväveatomen i mellanprodukten tar emot en proton, bildar en amidgrupp, och efterföljande omarrangemang bryter bindningen mellan den och mellanprodukten och bildar två produkter [15] .
Inhibitorer innehåller typiskt icke-hydrolyserbara hydroxietylen- eller hydroxietylamingrupper, som efterliknar den tetraedriska mellanprodukten. Eftersom de har en liknande struktur och elektrostatiskt arrangemang som substratens övergångstillstånd, kan de fortfarande passa in i den aktiva platsen, men kan inte förstöras, så hydrolys kan inte inträffa.
Strychnin är ett nervgift som orsakar döden genom att påverka nerverna som kontrollerar muskelsammandragning och orsakar andningssvårigheter. Impulsen överförs mellan synapser via en signalsubstans som kallas acetylkolin . Det går in i synapsen mellan nervceller och binder till receptorer på den postsynaptiska cellen. En aktionspotential genereras sedan och sänds genom den postsynaptiska cellen för att starta en ny cykel.
Glycin kan hämma aktiviteten hos neurotransmittorreceptorer, så mer acetylkolinesteras krävs för att utlösa en aktionspotential. Detta säkerställer att genereringen av nervimpulser är noggrant kontrollerad. Denna kontroll överträds dock när stryknin tillsätts. Det hämmar glycinreceptorer ( kloridkanal ) och en mycket lägre koncentration av signalsubstansen kan utlösa en aktionspotential. Nerverna sänder nu ständigt signaler och orsakar överdriven muskelkontraktion, vilket leder till kvävning och död [16] .
Diisopropylfluorofosfat (DIFP) är en irreversibel hämmare som blockerar verkan av serinproteas . När det binder till enzymet uppstår en nukleofil substitutionsreaktion som frigör en molekyl vätefluorid. OH-gruppen på det aktiva stället fungerar som en nukleofil, attackerar fosforn i DIFP, bildar en tetraedrisk mellanprodukt och frigör en proton. Sedan bryts PF-bindningen, en elektron överförs till F-atomen, och den lämnar mellanföreningen i form av F - anjonen. Den kombineras med en proton i lösning för att bilda en HF-molekyl. En kovalent bindning bildas mellan det aktiva stället och DIFP, så serinsidokedjan är inte längre tillgänglig för substratet [17] .
Identifieringen av aktiva platser är avgörande i processen för upptäckt av läkemedel. Enzymets tredimensionella struktur analyseras för att bestämma aminosyraresterna på det aktiva stället och utveckla läkemedel som kan passa i dem. Proteolytiska enzymer är måltavlor för vissa läkemedel, såsom proteashämmare, som inkluderar läkemedel mot AIDS och högt blodtryck [18] . Dessa proteashämmare binder till det aktiva stället för enzymet och blockerar interaktion med naturliga substrat [19] . En viktig faktor i läkemedelsutvecklingen är styrkan i bindningen mellan det aktiva stället och enzyminhibitorn [20] . Om enzymet som finns i bakterien skiljer sig väsentligt från det mänskliga enzymet, så är det möjligt att utveckla en inhibitor mot just den bakterien utan att skada det mänskliga enzymet. Om en typ av enzym finns i endast en typ av organism, kan dess inhibitor användas för att döda dem.
Aktiva platser kan kartläggas för att hjälpa till att utveckla nya läkemedel som enzymhämmare. Detta inkluderar en beskrivning av storleken på det aktiva stället, antalet och egenskaperna hos underställen, såsom detaljerna om bindningsinteraktionen [18] . Men modern databasteknik som kallas CPASS (Protein Active Site Structure Comparison) tillåter mer detaljerad jämförelse av aktiva platser och att hitta strukturella likheter med hjälp av programvara [21] .
| Exempel | Handlingsmekanism | |
|---|---|---|
| Antibakteriellt medel | Penicillin | Den bakteriella cellväggen består av peptidoglykan . Under bakterietillväxt störs den befintliga tvärbindningen av peptidoglykanfibern så att den nya cellväggmonomeren kan integreras i cellväggen. Penicillin verkar genom att hämma transpeptidas, vilket är nödvändigt för tvärbindning, så cellväggen försvagas och brister på grund av turgortryck . |
| svampdödande medel | Azol | Ergosterol är en sterol som bildar svampens ytmembran . Azol kan undertrycka sin biosyntes genom att hämma lanosterol-14-alfa-demetylas, så ny ergosterol produceras inte och skadlig 14-alfa-lanosterol ackumuleras i cellen. Dessutom kan azol generera reaktiva syrearter . |
| Antiviralt medel | Saquinavir | HIV-proteas krävs för att klyva Gag-Pol-polyproteinet till 3 separata proteiner så att de kan fungera korrekt och starta viruspaketeringsprocessen. HIV-proteashämmare som saquinavir hämmar det så att en ny mogen viral partikel inte kan skördas. |
| Insekticider | Fysiostigmin | I djurets nervsystem krävs acetylkolinesteras för att bryta ner signalsubstansen acetylkolin till acetat och kolin . Fysiostigmin binder till sitt aktiva ställe och undertrycker det, så impulssignalen kan inte överföras längs nerverna. Detta leder till att insekter dör, eftersom de tappar kontrollen över musklernas och hjärtats arbete. |
| herbicider | Cyklohexandion | Cyklohexandion riktar sig mot acetyl-CoA-karboxylas, som är involverat i det första steget i fettsyntesen: den ATP-beroende karboxyleringen av acetyl-CoA till malonyl-CoA. Lipider spelar en viktig roll i cellmembranets sammansättning. |
Ett allosteriskt ställe är ett ställe på ett enzym, som inte är associerat med dess aktiva ställe, som kan binda en effektormolekyl. Denna interaktion är en annan mekanism för enzymreglering. Allosterisk modifiering sker vanligtvis i proteiner med mer än en subenhet. Allosteriska interaktioner är ofta närvarande i metabola vägar och är användbara genom att de tillåter ett reaktionssteg att reglera ett annat steg [19] . De tillåter enzymet att ha ett antal ytterligare molekylära interaktioner utöver det mycket specifika aktiva stället [19] .
| Enzymer | |
|---|---|
| Aktivitet | |
| förordning | |
| Klassificering | |
| Typer |
|