| pyruvatkinas | |
|---|---|
| Identifierare | |
| Kod KF | 2.7.1.40 |
| Enzymdatabaser | |
| IntEnz | IntEnz-vy |
| BRENDA | BRENDA inträde |
| ExPASy | NiceZyme-vy |
| MetaCyc | Metabolisk väg |
| KEGG | KEGG inträde |
| PRIAM | profil |
| PDB- strukturer | RCSB PDB PDBe PDBj PDBsum |
| Sök | |
| PMC | artiklar |
| PubMed | artiklar |
| NCBI | NCBI-proteiner |
| Mediafiler på Wikimedia Commons | |
Pyruvatkinas är ett enzym från klassen transferaser ( EG-kod 2.7.1.40 ) som ingår i det sista steget i glykolysen . Det katalyserar överföringen av en fosfatgrupp från fosfoenolpyruvat (PEP) till adenosindifosfat (ADP), vilket producerar en pyruvatmolekyl och en ATP- molekyl [1] . Pyruvatkinas finns hos djur i fyra olika vävnadsspecifika isozymer, som var och en har specifika kinetiska egenskaper som är nödvändiga för att anpassa sig till de förändrade metaboliska behoven hos olika vävnader.
De fyra isozymerna av pyruvatkinas som uttrycks i ryggradsdjur är L (lever), R (erytrocyter), M1 (muskel och hjärna) och M2 (vävnad från tidigt foster och de flesta vuxna vävnader). L- och R-isoenzymer uttrycks av PKLR -genen , medan M1- och M2-isoenzymer uttrycks av PKM2 -genen . R- och L-isoenzymer skiljer sig från M1 och M2 genom att de är allosteriskt reglerade . Kinetiskt har R- och L-isoenzymer av pyruvatkinas två distinkta konformationstillstånd; en med hög substrataffinitet och en med låg substrataffinitet. R-tillståndet, kännetecknat av hög substrataffinitet, fungerar som en aktiverad form av pyruvatkinas och stabiliseras av PEP och fruktos 1,6-bisfosfat (FBP) för att främja den glykolytiska vägen. T-tillståndet, kännetecknat av låg substrataffinitet, fungerar som en inaktiverad form av pyruvatkinas bundet och stabiliserat av ATP och alanin , vilket orsakar pyruvatkinasfosforylering och hämning av glykolys [2] . M2-isoenzymet av pyruvatkinas kan bilda tetramerer eller dimerer. Tetramerer har hög affinitet för PEP medan dimerer har låg affinitet för PEP. Enzymatisk aktivitet kan regleras genom fosforylering av högaktiva PKM2-tetramerer till inaktiva dimerer [3] .
PKM-genen består av 12 exoner och 11 introner . PKM1 och PKM2 är olika splitsningsprodukter av M-genen ( PKM1 innehåller exon 9 och PKM2 innehåller exon 10) och skiljer sig endast med 23 aminosyror inom 56-aminosyraregionen (a.a. 378-434) vid deras karboxiterminal [4] [5] . PKM - genen regleras av heterogena ribonukleotidproteiner såsom hnRNPA1 och hnRNPA2 [6] . Den humana PKM2-monomeren består av 531 aminosyror och är en enkelkedja uppdelad i domänerna A, B och C. Skillnaden i aminosyrasekvens mellan PKM1 och PKM2 gör att PKM2 kan regleras allosteriskt av FBP och bilda dimerer och tetramerer, medan PKM1 kan bildar endast tetramerer [7] .
Många enterobakterier, inklusive E. coli , har två isoformer av pyruvatkinas, PykA och PykF, som är 37 % identiska i E. coli (Uniprot: PykA Archived 27 March 2022 at the Wayback Machine , PykF Archived 15 April 2021 at the Wayback Machine ). De katalyserar samma reaktion som i eukaryoter, nämligen bildandet av ATP från ADP och fosfoenolpyruvat , det sista steget i glykolysen , ett steg som är irreversibelt under fysiologiska förhållanden. PykF regleras allosteriskt av FBP, vilket återspeglar PykFs centrala position i cellulär metabolism [8] . Transkription av PykF i E. coli regleras av den globala transkriptionsregulatorn Cra (FruR) [9] [10] [11] . PfkB har visat sig hämmas av MgATP vid låga koncentrationer av Fru-6P och denna reglering är viktig för glukoneogenes [12] .
Pyruvatkinasreaktion under glykolys sker i två steg. Först överför PEP fosfatgruppen till ADP, vilket producerar ATP och pyruvatenolat . För det andra måste en proton läggas till pyruvatenolatet för att erhålla den funktionella formen av pyruvat som cellen kräver [13] . Eftersom substratet för pyruvatkinas är ett enkelt fosfo-socker och produkten är ATP, är pyruvatkinas ett möjligt primärt enzym för utvecklingen av glykolyscykeln och kan vara ett av de äldsta enzymerna i allt jordlevande liv. Fosfoenolpyruvat kan vara närvarande abiotiskt och har visat sig produceras i högt utbyte från den primitiva triosglykolysvägen [14] .
I jästceller visade sig interaktionen av jästpyruvatkinas (YPK) med PEP och dess allosteriska effektor fruktos 1,6-bisfosfat (FBP) förstärkas av närvaron av Mg2 + . Således drogs slutsatsen att Mg 2+ är en viktig kofaktor i katalysen av PEP till pyruvat genom pyruvatkinas. Dessutom har metalljonen Mn 2+ visat sig ha en liknande men starkare effekt på YPK än Mg 2+ . Bindning av metalljoner till metallbindningsställen på pyruvatkinas ökar hastigheten för denna reaktion [15] .
Reaktionen som katalyseras av pyruvatkinas är det sista steget i glykolysen. Detta är ett av de tre stegen i denna väg som begränsar hastigheten. Hastighetsbegränsande steg är långsammare, kontrollerade steg på banan och bestämmer därmed banans totala hastighet. Vid glykolys är de hastighetsbegränsande stegen associerade med antingen ATP-hydrolys eller ADP-fosforylering, vilket gör denna väg energiskt gynnsam och i huvudsak irreversibel i celler. Detta sista steg är mycket reglerat och avsiktligt irreversibelt, eftersom pyruvat är en viktig mellanliggande byggsten för ytterligare metaboliska vägar [16] . När pyruvat väl har producerats går det antingen in i Krebs-cykeln för ytterligare ATP-produktion under aeroba förhållanden, eller omvandlas till mjölksyra eller etanol under anaeroba förhållanden.
Pyruvatkinas fungerar också som ett reglerande enzym för glukoneogenes , den biokemiska vägen genom vilken levern producerar glukos från pyruvat och andra substrat. Glukoneogenes använder icke-kolhydratkällor för att ge glukos till hjärnan och röda blodkroppar under fasta när direkta glukosdepåer är uttömda [16] . Under svält hämmas pyruvatkinas, vilket förhindrar att "läckaget" av fosfoenolpyruvat omvandlas till pyruvat; istället omvandlas fosfoenolpyruvat till glukos genom en kaskad av glukoneogenesreaktioner. Även om den använder liknande enzymer, är glukoneogenes inte motsatsen till glykolys. Istället är det en väg som undviker de irreversibla stegen av glykolys. Dessutom sker inte glukoneogenes och glykolys samtidigt i en cell vid något givet ögonblick, eftersom de regleras ömsesidigt av cellulär signalering. Efter fullbordandet av glukoneogenesvägen utsöndras den producerade glukosen från levern, vilket ger energi till vitala vävnader i svälttillstånd.
Glykolys är starkt reglerad i tre katalytiska steg: fosforylering av glukos genom hexokinas , fosforylering av fruktos-6-fosfat av fosfofruktokinas och överföring av fosfat från PEP till ADP med pyruvatkinas. Under vildtypsförhållanden är alla dessa tre reaktioner irreversibla, har en stor negativ fri energi och är ansvariga för regleringen av denna väg [16] . Pyruvatkinasaktivitet regleras mest av allosteriska effektorer, kovalenta modifierare och hormonell kontroll. Den viktigaste regulatorn av pyruvatkinas är dock fruktos 1,6-bisfosfat (FBP), som fungerar som en allosterisk effektor för enzymet.
Allosterisk reglering är bindningen av en effektor till ett annat proteinställe än det aktiva stället, vilket orsakar en konformationsförändring och en förändring i aktiviteten hos det proteinet eller enzymet. Pyruvatkinas har visat sig vara allosteriskt aktiverat av FBP och allosteriskt inaktiverat av ATP och alanin [17] . Pyruvatkinas-tetramerisering underlättas av FBP och serin, medan dissociation av tetramer underlättas av L-cystein [18] [19] [20] .
Fruktos 1,6-bisfosfatFBP är den viktigaste källan till reglering eftersom det kommer från glykolysvägen. FBP är en glykolysmellanprodukt som härrör från fosforyleringen av fruktos-6-fosfat . FBP binder till ett allosteriskt bindningsställe i C-domänen av pyruvatkinas och ändrar konformationen av enzymet, vilket gör att pyruvatkinasaktiviteten aktiveras. [21] Som en mellanprodukt närvarande i den glykolytiska vägen, ger FBP direkt stimulering eftersom ju högre koncentration av FBP, desto högre är den allosteriska aktiveringen och storleken på pyruvatkinasaktivitet. Pyruvatkinas är det mest känsliga för verkan av FBP. Som ett resultat tjänar de återstående regleringsmekanismerna som en sekundär modifiering [8] [22] .
Kovalenta modifierare fungerar som indirekta regulatorer, kontrollerar fosforylering, defosforylering, acetylering, succinylering och oxidation av enzymer, vilket leder till aktivering och hämning av enzymatisk aktivitet [23] . I levern aktiverar glukagon och epinefrin proteinkinas A , som fungerar som en kovalent modifierare genom fosforylering och deaktivering av pyruvatkinas. Omvänt aktiverar insulinutsöndring som svar på stigande blodsocker fosfoproteinfosfatas I , vilket orsakar defosforylering och pyruvatkinasaktivering för att öka glykolysen. Samma kovalenta modifiering har motsatt effekt på enzymerna av glukoneogenes. Detta reglerande system är ansvarigt för att förhindra en värdelös cykel genom att förhindra samtidig aktivering av pyruvatkinas och enzymerna som katalyserar glukoneogenes [24] .
Carbohydrate Response Element Binding Protein (ChREBP)ChREBP visade sig vara ett viktigt protein i transkriptionen av gener för L-isoenzymet av pyruvatkinas. ChREBP-domänerna är målställen för reglering av pyruvatkinas genom glukos och cAMP. I synnerhet aktiveras ChREBP av högt glukos och hämmas av cAMP. Glukos och cAMP motsätter sig varandra genom att reglera kovalenta modifierare. CAMP binder till Ser196- och Thr666-bindningsställena i ChREBP, vilket orsakar fosforylering och inaktivering av pyruvatkinas; glukos binder till Ser196- och Thr666-bindningsställena i ChREBP, vilket orsakar defosforylering och aktivering av pyruvatkinas. Som ett resultat har cAMP och överskott av kolhydrater visat sig spela en indirekt roll i regleringen av pyruvatkinas [25] .
För att förhindra en värdelös cykel är glykolys och glukoneogenes hårt reglerade för att säkerställa att de aldrig fungerar i en cell samtidigt. Som ett resultat stoppar hämning av pyruvatkinas av glukagon, cykliskt AMP och adrenalin inte bara glykolysen utan stimulerar också glukoneogenesen. Å andra sidan stör insulin effekten av glukagon, cyklisk AMP och adrenalin, vilket gör att pyruvatkinas fungerar normalt och stoppar glukoneogenesen. Dessutom har glukos visat sig hämma och försämra glukoneogenesen utan att påverka pyruvatkinasaktivitet och glykolys. Generellt sett spelar interaktionen mellan hormoner en nyckelroll i funktionen och regleringen av glykolys och glukoneogenes i cellen [26] .
Den hämmande effekten av metforminMetformin, eller dimetylbiguanid , är den primära behandlingen för typ 2-diabetes. Metformin har visat sig indirekt påverka pyruvatkinas genom hämning av glukoneogenes. Specifikt är metformintillskott associerat med en markant minskning av glukosflödet och en ökning av laktat/pyruvatflödet från olika metabola vägar. Även om metformin inte direkt påverkar pyruvatkinasaktiviteten, orsakar det en minskning av ATP-koncentrationen. På grund av de allosteriska hämmande effekterna av ATP på pyruvatkinas, resulterar en minskning av ATP i minskad hämning och efterföljande stimulering av pyruvatkinas. Därför styr en ökning av pyruvatkinasaktivitet det metaboliska flödet genom glykolys snarare än genom glukoneogenes [27] .
Heterogena ribonukleotidproteiner (hnRNP) kan verka på PKM-genen för att reglera uttrycket av M1- och M2-isoformerna. PKM1- och PKM2-isoformerna är splitsningsvarianter av PKM-genen som skiljer sig åt med en exon. Olika typer av hnRNP, såsom hnRNPA1 och hnRNPA2, kommer in i kärnan under hypoxiska förhållanden och modulerar uttryck så att PKM2 aktiveras. [28] Hormoner som insulin ökar PKM2-uttrycket medan hormoner som tri-jodtyronin (T3) och glukagon minskar PKM2-nivåerna [29] .
Genetiska defekter i detta enzym orsakar sjukdomen känd som pyruvatkinasbrist . I detta tillstånd saktar bristen på pyruvatkinas ner processen för glykolys. Denna effekt är särskilt skadlig för celler som saknar mitokondrier , eftersom dessa celler måste använda anaerob glykolys som sin enda energikälla, eftersom Krebs-cykeln inte är tillgänglig. Till exempel blir röda blodkroppar som är i ett tillstånd av pyruvatkinasbrist snabbt ATP-brist och kan genomgå hemolys . Därför kan pyruvatkinasbrist orsaka kronisk ickesfärocytisk hemolytisk anemi (CNSHA) [30] .
Mutation av PK-LR-genenPyruvatkinasbrist orsakas av ett autosomalt recessivt drag. Däggdjur har två pyruvatkinasgener, PK-LR (som kodar för L- och R-pyruvatkinasisozymer) och PK-M (som kodar för M1-pyruvatkinasisozymet), men endast PKLR kodar för det röda blodisozymet som orsakar pyruvatkinasbrist. Över 250 mutationer i PK-LR-genen har identifierats och är associerade med pyruvatkinasbrist. DNA-tester har lett till upptäckten av lokaliseringen av PKLR på kromosom 1 och utvecklingen av direkta gensekvenseringstester för molekylär diagnos av pyruvatkinasbrist [31] .
Reaktiva syrearter (ROS) är reaktiva syrearter. I mänskliga lungceller har ROS visat sig hämma M2-isoenzymet av pyruvatkinas (PKM2). ROS uppnår denna hämning genom att oxidera Cys358 och inaktivera PKM2. Som ett resultat av PKM2-inaktivering omvandlas glukosflödet inte längre till pyruvat, utan används istället i pentosfosfatvägen, vilket leder till en minskning och avgiftning av ROS. Således förstärks de skadliga effekterna av ROS och orsakar större oxidativ stress på lungceller, vilket leder till potentiell tumörbildning. Denna hämmande mekanism är viktig eftersom det kan tyda på att regleringsmekanismer i PKM2 är ansvariga för att främja cancercellers motståndskraft mot oxidativ stress och förbättra tumörbildningen [32] [33] .
FenylalaninhämningFenylalanin har visat sig fungera som en kompetitiv hämmare av pyruvatkinas i hjärnan. Även om graden av hämmande aktivitet av fenylalanin är densamma i både fosterceller och vuxna celler, är enzymer i fostrets hjärnceller betydligt mer känsliga för hämning än enzymer i vuxna hjärnceller. En studie av PKM2 hos barn med den genetiska hjärnstörningen fenylketonuri (PKU) visade förhöjda nivåer av fenylalanin och en minskning av effektiviteten av PKM2. Denna hämningsmekanism ger insikt i rollen av pyruvatkinas i hjärncellskada [34] [35] .
Cancerceller har en karakteristisk accelererad metabolisk mekanism, och pyruvatkinas tros spela en roll i cancerutvecklingen. Jämfört med friska celler har cancerceller förhöjda nivåer av PKM2-isoformen, speciellt dimeren med låg aktivitet. Därför används serum PKM2-nivåer som cancermarkörer. Dimeren med låg aktivitet tillåter ackumulering av fosfoenolpyruvat (PEP), vilket lämnar stora koncentrationer av glykolytiska mellanprodukter för syntesen av biomolekyler som så småningom kommer att användas av cancerceller [7] . Fosforylering av PKM2 av mitogenaktiverat proteinkinas 1 (ERK2) inducerar en konformationsförändring som gör att PKM2 kan komma in i kärnan och reglera glykolytiskt genuttryck som krävs för tumörutveckling [36] . Vissa studier hävdar att det under karcinogenesen sker en förändring i uttrycket från PKM1 till PKM2. Tumörmikromiljön, såsom hypoxi, aktiverar transkriptionsfaktorer, såsom hypoxiinducerbar faktor , för att främja PKM2-transkription, som bildar en positiv återkopplingsslinga för att förbättra sin egen transkription.
Ett reversibelt enzym med liknande funktion, pyruvatfosfatdikinas (PPDK), finns i vissa bakterier och har överförts till ett antal eukaryota anaeroba grupper (t.ex. Streblomastix , Giardia , Entamoeba och Trichomonas ), uppenbarligen via en horisontell translationsgen i två eller flera fall. I vissa fall kommer samma organism att ha både pyruvatkinas och PPDK [37] .
| Enzymer | |
|---|---|
| Aktivitet | |
| förordning | |
| Klassificering | |
| Typer |
|