Trikarboxylsyracykeln (förkortning CTK , Krebs cykel , citratcykel , citronsyracykel [1] [2] ) är den centrala delen av den allmänna katabolismens väg , en cyklisk biokemisk process under vilken acetyl rester (CH 3 ) CO-) oxideras till koldioxid (CO 2 ). I detta fall bildas 2 molekyler CO 2 , 3 NADH , 1 FAD H 2 och 1 GTP i en cykel (ellerATP ) [3] . Elektroner lokaliserade på NADH och FADH 2 överförs därefter till andningskedjan [2] , där ATP bildas under oxidativa fosforyleringsreaktioner .
Trikarboxylsyracykeln är ett nyckelsteg i andningen av alla celler som använder syre , skärningspunkten för många metabola vägar i kroppen , ett mellansteg mellan glykolys och elektrontransportkedjan . Förutom en betydande energiroll spelar cykeln också en betydande plastisk funktion, det vill säga den är en viktig källa till prekursormolekyler, från vilka, under andra biokemiska omvandlingar, sådana viktiga föreningar för celllivet som aminosyror , kolhydrater , fettsyror , etc. syntetiseras [4]
Citronsyraomvandlingscykeln i levande celler (det vill säga trikarboxylsyracykeln) upptäcktes och studerades av den tyske biokemisten Hans Krebs , för detta arbete tilldelades han (tillsammans med F. Lipman ) Nobelpriset (1953) [1] .
Hos eukaryoter sker alla reaktioner i Krebs-cykeln inuti mitokondrierna , och hos de flesta bakterier sker cykelns reaktioner i cytosolen [5] .
I början av trikarboxylsyracykeln ger acetyl-koenzym A (acetyl-CoA) upp sin acetylgrupp till en förening med fyra kolatomer - oxaloacetat (oxaloättiksyra), och sexkolscitrat (citronsyra) bildas. Acetyl-CoA är en oxidationsprodukt av föreningar som glukos , aminosyror och fettsyror [6] . Citratet isomeriseras sedan till isocitrat (isocitronsyra), som dehydreras ytterligare och dekarboxyleras till en syra med fem kolatomer , α-ketoglutarat . α-Ketoglutarat dekarboxyleras igen och omvandlas till fyrkolssuccinat (bärnstenssyra). Succinatet omvandlas sedan enzymatiskt i tre steg till fyrkolsoxaloacetat, som är redo att reagera med den nya acetyl-CoA-molekylen. I varje varv av cykeln kommer en acetylgrupp (det vill säga två kolatomer ) in i cykeln i form av acetyl-CoA, och två kolatomer lämnar cykeln i form av två CO 2 -molekyler ; en oxaloacetatmolekyl används för att bilda citrat, och en regenereras därefter. Oxaloacetat lämnar inte cykeln, och en molekyl oxaloacetat kan teoretiskt binda ett obegränsat antal acetylgrupper och i själva verket finns oxaloacetat i celler i mycket låga koncentrationer. Fyra av de åtta stegen i cykeln är oxidativa processer, oxidationsenergin som frigörs under dessa processer lagras effektivt i form av reducerade koenzymer NADH och FADH 2 [5] .
Även om trikarboxylsyracykeln är central för energimetabolism , är dess roll inte begränsad till att erhålla och lagra energi. Ringmellanprodukter med fyra och fem kolatomer tjänar som prekursorer för syntesen av många föreningar. För att fylla på dessa mellanliggande föreningar som har lämnat cykeln finns det speciella anaplerotiska reaktioner i cellen [5] .
Som nämnts ovan sker alla reaktioner i trikarboxylsyracykeln i mitokondrier, och andningskedjan är belägen i mitokondrierna (på det inre membranet ). Hos de flesta bakterier finns enzymerna i trikarboxylsyracykeln i cytosolen, och plasmamembranet utför funktioner som liknar dem i mitokondriernas inre membran [5] .
Trikarboxylsyracykeln inkluderar 8 huvudstadier, som diskuteras i detalj nedan.
Den första reaktionen i cykeln är den irreversibla kondensationen av acetyl-CoA med oxaloacetat för att bilda citrat , katalyserad av enzymet citratsyntas (reaktion 1 i det allmänna schemat):
I denna reaktion tillsätts metylgruppen i acetylgruppen i acetyl-CoA till karbonylgruppen (andra kolatomen, C2-atom) i oxaloacetat . Under denna reaktion bildas en intermediär förening i enzymets aktiva centrum - citroyl-CoA . Det hydrolyseras snabbt och klyvs till fritt CoA och citrat, som avlägsnas från enzymets aktiva plats . Hydrolys av denna högenergitioetermellanprodukt gör denna reaktion mycket exergonisk . En stor negativ förändring i den fria standardenergin för citratsyntasreaktionen är nödvändig för cykelkontroll, eftersom, som noterats tidigare, den normala koncentrationen av oxaloacetat i cellen är mycket låg. CoA som frigörs under denna reaktion är vidare involverad i den oxidativa dekarboxyleringen av nästa pyruvatmolekyl av pyruvatdehydrogenaskomplexet [ 7] .
Citratsyntas kristalliserades och röntgendiffraktion analyserades i närvaro och frånvaro av dess substrat och inhibitorer . Varje subenhet av detta homodimera enzym är en enda polypeptid med två domäner , av vilka en är stor och stel och den andra är mindre och mer plastisk; mellan dessa domäner finns det aktiva stället för enzymet. Oxaloacetat, det första av de citratsyntasbindande substraten, inducerar betydande konformationsförändringar i plastdomänen, vilket skapar ett bindningsställe för den andra substratmolekylen, acetyl-CoA (se höger). När citroyl-CoA bildas i enzymets aktiva ställe sker en andra konformationsförändring i enzymet på grund av hydrolys av tioestern för att frigöra CoA. Dessa konformationsförändringar, orsakade först av bindning till substratet och sedan till mellanprodukten, förhindrar för tidig och improduktiv klyvning av tioeterbindningen i acetyl-CoA. Kinetiska studier av citratsyntas bekräftar tvåsubstratmekanismen för dess funktion som beskrivs ovan. Ovanstående citratsyntasreaktion är en aldolkondensation [8] [9] (en del författare anser det dock vara en Claisen-kondensation [7] ). Nedan är mekanismen för citratsyntasreaktionen:
Enzymet akonitas (mer exakt, akonitathydratas) katalyserar den reversibla isomeriseringen av citrat till isocitrat genom bildning av en mellanliggande förening - trikarboxylsyra- cis-akonitat , som normalt inte lämnar det aktiva centret. Akonitas tillsätter vatten till dubbelbindningen av cis -akonitatet som är associerad med dess aktiva centrum på två olika sätt: som ett resultat av ett av dem bildas citrat, som ett resultat av det andra, isocitrat (reaktioner 2 och 3 i allmänhet schema) [7] :
Även om jämviktsblandningen vid pH 7,4 och 25 ° C innehåller mindre än 10 % isocitrat, förskjuts reaktionen åt höger i cellen, eftersom isocitrat snabbt dras in i nästa steg i cykeln och dess koncentration minskar. Aconitase innehåller ett järn-svavelkluster , som tjänar både till att binda substratet på det aktiva stället och katalytiskt hydratisera eller dehydratisera. I celler som inte innehåller tillräckligt med järn förlorar aconitas sin järn-svavelkluster och får en reglerande roll i järnmetabolismen (se IRE (biologi) för detaljer ). Således är akonitas ett av många enzymer med två distinkta funktioner [10] .
Nedan är ett diagram som illustrerar hur akonitasjärn-svavelklustret binder isocitrat och omvandlar det till cis -akonitat:
I nästa steg katalyserar enzymet isocitratdehydrogenas den oxidativa dekarboxyleringen isocitrat för att bilda α-ketoglutarat (oxoglutarat). Mn 2+ (eller Mg 2+ ) -jonen [11] i enzymets aktiva ställe interagerar med karbonylgruppen i intermediären oxalosuccinat , som bildas snabbt, men lämnar inte det aktiva stället förrän det dekarboxyleras och omvandlas till α-ketoglutarat [10] .
Dessa transformationer diskuteras i detalj nedan (reaktionerna 4 och 5 i det allmänna schemat):
Två olika former (isozymer) av isocitratdehydrogenas har hittats i celler. För att en av dem ska fungera behövs NAD + , för den andra NADP + (detta kräver aktiviteten hos den senare Mg 2+-jonen och inte Mn 2+ [11] ). Reaktionerna de genomför är i övrigt identiska. I eukaryoter är det NAD-beroende isozymet lokaliserat i mitokondriella matrisen och är involverat i trikarboxylsyracykeln. Huvudfunktionen hos det NADP-beroende isozymet, som förekommer både i mitokondriella matrisen och i cytosolen, kan vara bildningen av NADPH , vilket är nödvändigt för restaurerande anabola processer [13] .
I nästa steg av trikarboxylsyracykeln sker också oxidativ dekarboxylering, där α-ketoglutarat omvandlas till succinyl-CoA och CO 2 under verkan av α-ketoglutarat-dehydrogenaskomplexet ; NAD + fungerar som en elektronacceptor , medan CoA fungerar som en bärare av succinylgrupper. Oxidationsenergin för α-ketoglutarat lagras under bildandet av en tioeterbindning i succinyl-CoA [13] (reaktion 6 i det allmänna schemat):
Denna reaktion är nästan identisk med pyruvatdehydrogenasreaktionen av den oxidativa dekarboxyleringen av pyruvat, och a-ketoglutaratdehydrogenaskomplexet är extremt nära pyruvatdehydrogenaskomplexet (PDC) i struktur och funktion. Den inkluderar 3 enzymer homologa med enzymerna E 1 , E 2 och E 3 MPC, och dess kofaktorer är också tiaminpyrofosfat , lipoat , FAD, NAD och koenzym A. Utan tvekan har båda komplexen en gemensam evolutionär förfader. Även om E 1 - enzymerna i båda komplexen är strukturellt lika, skiljer sig deras aminosyrasekvenser och, naturligtvis, är de specifika för olika substrat: E 1 i PDC-komplexet binder pyruvat och E 1 i α-ketoglutaratdehydrogenaskomplexet binder α-ketoglutarat. E 2 enzymerna i båda komplexen är också mycket lika och båda binder kovalent till lipoatet. E 3 -subenheterna för båda komplexen är identiska [14] .
Succinyl-CoA, liksom acetyl-CoA, innehåller en tioeterbindning med en stor negativ standard fri hydrolysenergi (ΔG'® ≈ −36 kJ/mol). I nästa steg av trikarboxylsyracykeln används energin som frigörs under klyvningen av tioeterbindningen för att bilda fosfoanhydridbindningen i GTP eller ATP, medan succinyl-CoA omvandlas till succinat [14] (reaktion 6 i det allmänna systemet):
Denna reversibla reaktion katalyseras av enzymet succinyl-CoA-syntetas (succinyltiokinas); båda namnen på detta enzym antyder att nukleosidtrifosfat är involverat i denna reaktion [14] .
Denna energilagrande reaktion inkluderar mellanliggande steg i vilka själva enzymmolekylen blir fosforylerad vid histidinresten i det aktiva stället. Denna fosforylgrupp, som har en hög överföringspotential, överförs till ADP eller GDP för att bilda ATP respektive GTP. Djurceller har två isozymer av succinyl-CoA-syntetas, varav en är specifik för ADP och den andra för GDP. Succinyl-CoA-syntetas består av två subenheter: a-subenheten ( Mr = 32 000) innehåller en fosforylerad histidinrest (His 246 ) och ett CoA-bindningsställe, och β-subenheten (M r = 42 000) ger bindningsspecificitet till ADP eller BNP. Den aktiva platsen är belägen i utrymmet mellan underenheterna. Kristallstrukturen av succinyl-CoA-syntetas innehåller två "power helices" ( engelska power helices ), en i varje subenhet, och dessa spiraler är orienterade på ett sådant sätt att deras elektriska dipolmoment skiftar delvis positiva laddningar till ett negativt laddat histidinfosfat ( P-His ); på grund av detta stabiliseras den mellanliggande fosforylerade formen av enzymet [15] . Följande är ett reaktionsschema katalyserat av succinyl-CoA-syntetas:
Bildandet av ATP (eller GTP) från energin som lagras under den oxidativa dekarboxyleringen av α-ketoglutarat är en substratfosforyleringsreaktion , liksom syntesen av ATP under glykolys , katalyserad av glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas och pyru . GTP syntetiserat av succinyl-CoA-syntetas kan donera sin terminala fosforylgrupp till ADP för att bilda ATP i en reversibel reaktion katalyserad av nukleosid-difosfatkinas :
GTP + ADP → GDP + ATP, ΔG′ o = 0 kJ/mol.Sålunda är slutresultatet av aktiviteten av något isozym av succinyl-CoA-syntetas lagring av energi i form av ATP. Förändringen i Gibbs-energin i nukleosid-difosfatkinasreaktionen är noll, och ATP och GTP är energimässigt ekvivalenta med varandra [16] .
Succinat bildat av succinyl-CoA oxideras till fumarat under verkan av flavoproteinet succinatdehydrogenas [17] (reaktion 8 i det allmänna schemat):
I eukaryoter är succinatdehydrogenas tätt bundet till mitokondriernas inre membran ; hos bakterier är det lokaliserat på plasmamembranet. Detta enzym innehåller 3 olika järn-svavelkluster och en molekyl kovalent bunden FAD, som är enzymets protesgrupp . Elektroner från succinat passerar genom FAD och järn-svavelkluster, och sedan kommer de som elektronbärare in i den respiratoriska elektrontransportkedjan som ligger på det inre mitokondriella membranet (plasmamembran i bakterier). FAD reduceras till FADH 2 , men ubikinon är en ytterligare elektronacceptor [2] . Överföringen av elektroner från succinat genom dessa bärare till den slutliga elektronacceptorn, syre , är associerad med syntesen av ATP, och 1,5 ATP-molekyler bildas per elektronpar. Malonat , normalt frånvarande i celler, är en stark kompetitiv hämmare av succinatdehydrogenas, och tillsatsen av denna förening till mitokondrier blockerar aktiviteten av trikarboxylsyracykeln [17] .
Den reversibla hydreringen av fumarat för att bilda L -malat katalyseras av enzymet fumaras (mer exakt fumarathydratas ). Övergångsprodukten av denna reaktion är en karbanjon [17] (reaktion 9 i det allmänna schemat):
Mekanismen för fumarasreaktionen presenteras mer i detalj nedan:
Fumaras är ett stereospecifikt enzym: det katalyserar hydratiseringen av dubbelbindningen i fumarat ( trans - isomeren ), men inte i ( cis - isomeren av fumarat). Fumaras uppvisar också stereospecificitet i den omvända reaktionen: D-malat kan inte fungera som ett substrat för det [17] .
I den sista reaktionen av trikarboxylsyracykeln katalyserar det NAD-beroende enzymet L - malatdehydrogenas oxidationen av L-malat till oxaloacetat [17] (reaktion 10 i det allmänna schemat):
Under standardmässiga termodynamiska förhållanden är jämvikten för denna reaktion kraftigt förskjuten till vänster, men i en levande cell är oxaloacetat ständigt involverat i den mycket exergoniska citratsyntasreaktionen (steg 1). Detta upprätthåller en extremt låg koncentration av oxaloacetat i cellen (< 10 −6 M), på grund av vilket jämvikten i malatdehydrogenasreaktionen skiftar åt höger [17] .
Även om enzymerna i trikarboxylsyracykeln vanligtvis beskrivs som lösliga komponenter i den mitokondriella matrisen (förutom membranbundet succinatdehydrogenas), finns det allt fler bevis för att dessa enzymer existerar som multienzymkomplex i mitokondrierna . Cykelenzymer isolerades framgångsrikt från extrakt av förstörda celler, men multiproteinkomplex bildade på grund av icke-kovalenta interaktioner av ett protein med ett annat, eller med den strukturella komponenten av cellen ( membran , mikrotubuli , mikrofilament ) förstördes. När man bereder ett cellextrakt späds dock innehållet i cellerna, inklusive enzymer, 100 eller 1000 gånger [18] .
Ett antal bevis tyder på att multienzymkomplex i celler ger en effektiv övergång av reaktionsprodukterna från ett enzym till nästa enzym i vägen. Sådana komplex kallas metaboloner . Flera enzymer i trikarboxylsyracykeln har isolerats som en del av supramolekylära komplex eller har hittats associerade med mitokondriernas inre membran, eller har visats ha långsammare diffusionshastigheter än enskilda proteiner i lösning. Detta ger starka bevis för substratutbyte mellan multienzymkomplex och i andra metabola vägar, och många enzymer som anses vara "lösliga" bildar faktiskt mycket organiserade komplex som utbyter mellanprodukter [18] .
Reaktionerna som utgör ett varv av trikarboxylsyracykeln beaktades ovan. Acetylgruppen med två kol kommer in i cykeln genom att kombineras med oxaloacetat. Två kolatomer lämnar cykeln i form av två CO 2 -molekyler som bildas under oxidationen av isocitrat och α-ketoglutarat. Energin som frigörs under dessa oxidationsreaktioner lagras i form av reducerade tre NADH-molekyler, en FADH 2 - molekyl och en ATP- eller GTP-molekyl. I slutet av cykeln regenereras oxaloacetatmolekylen. Det är värt att notera att de två kolatomer som lämnar cykeln i form av två CO2-molekyler skiljer sig från de två kolatomer som kom in i cykeln (i denna tur) som en acetylgrupp. Kolatomerna som acetylgruppen för med sig kan lämna kretsloppet i form av CO 2 endast vid efterföljande cykelvarv [3] .
Även om citronsyracykeln endast producerar en ATP-molekyl per varv direkt (när succinyl-CoA omvandlas till succinat), förser cykelns fyra oxidativa reaktioner andningskedjan med ett betydande antal elektroner som tillförs av NADH och FADH 2 , och därmed ge en betydande mängd ATP in under oxidativ fosforylering [3] .
Under glykolys producerar en molekyl glukos två pyruvatmolekyler, 2 ATP och 2 NADH. Under oxidativ fosforylering producerar en tvåelektronövergång från NADH till O 2 2,5 ATP, och en tvåelektronövergång från FADH 2 till O 2 producerar 1,5 ATP. När båda pyruvatmolekylerna oxideras till 6 CO 2 av pyruvatdehydrogenaskomplexet och under trikarboxylsyracykeln, och elektroner överförs till O 2 under oxidativ fosforylering, är det totala ATP-utbytet 32 molekyler per glukosmolekyl [3] :
| Reaktion | Output av ATP eller reducerade koenzymer | Total ATP-utgång |
|---|---|---|
| glukos → glukos-6-fosfat | −1 ATP | −1 |
| fruktos 6-fosfat → fruktos 1,6-bisfosfat | −1 ATP | −1 |
| 2 glyceraldehyd-3-fosfat → 2 1,3-bisfosfoglycerat | 2 NADH | 3 eller 5 |
| 2 1,3-bisfosfoglycerat → 2 3-fosfoglycerat | 2 ATP | 2 |
| 2 fosfoenolpyruvat → 2 pyruvat | 2 ATP | 2 |
| 2 pyruvat → 2 acetyl-CoA | 2 NADH | 5 |
| 2 isocitrat → 2 α-ketoglutarat | 2 NADH | 5 |
| 2 a-ketoglutarat → 2 succinyl-CoA | 2 NADH | 5 |
| 2 succinyl-CoA → 2 succinat | 2 ATP (eller 2 GTP) | 2 |
| 2 succinat → 2 fumarat | 2 FADH 2 | 3 |
| 2 malat → 2 oxaloacetat | 2 NADH | 5 |
| Totalt : 30-32 |
32 ATP-molekyler motsvarar 32 × 30,5 kJ / mol = 976 kJ / mol, vilket är 34% av det teoretiska maximum för fullständig oxidation av glukos - 2 840 kJ / mol. Dessa beräkningar gjordes med hänsyn till standardvärdena för förändringar av fri energi, men om vi tar hänsyn till cellens verkliga behov av fri energi som finns i ATP, närmar sig effektiviteten av oxidationsprocessen 65% av det teoretiska maximalt [19] .
| Skede | ett | 2 | 3 | fyra | 5 | 6 | 7 | åtta |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| ΔG'°, kJ/mol | -32.2 | 13.3 | -7.1 | -33,5 | -2.9 | 0 | -3.8 | 29,7 |
Regleringen av enzymer i den metaboliska vägen kan utföras med hjälp av allosteriska effektorer och kovalenta modifieringar, upprätthålla koncentrationen av mellan- och slutprodukter i cellen konstant och förhindra överdriven bildning av dem. Övergången av kolatomer från pyruvat till trikarboxylsyracykeln är finreglerad på två nivåer: omvandlingen av pyruvat till acetyl-CoA, startföreningen för cykeln (pyruvatdehydrogenasreaktion), och inträdet av aktivt acetat i cykeln ( citratsyntasreaktion). Acetyl-CoA bildas inte bara av pyruvatdehydrogenaskomplexet (PDH), utan också av oxidation av fettsyror (β-oxidation) och vissa aminosyror, så kontroll av dessa vägar är också viktig för regleringen av pyruvatoxidation och trikarboxylsyracykeln. Dessutom regleras cykeln av isocitratdehydrogenas- och α-ketoglutaratdehydrogenasreaktioner. Nedan kommer vi att överväga regleringen av själva trikarboxylsyracykeln [20] ; för reglering av oxidativ dekarboxylering av pyruvat, se artikel Oxidativ dekarboxylering av pyruvat .
Således är metaboliters inträde i trikarboxylsyracykeln strikt reglerad. Intaget av metaboliter bestäms av tre faktorer: tillgängligheten av substratet, undertryckandet av ackumulerade produkter och allosterisk återkopplingsundertryckning av enzymer som katalyserar de inledande stadierna av cykeln [21] .
Vart och ett av de tre exergoniska stegen i cykeln – stegen som katalyseras av citratsyntas, isocitratdehydrogenas och α-ketoglutaratdehydrogenas – kan under vissa förhållanden bli hastighetsbegränsande . Tillgången på substrat för citratsyntas (acetyl-CoA och oxaloacetat) varierar beroende på cellens tillstånd och hämmar ibland hastigheten för citratbildning. NADH, oxidationsprodukten av isocitrat och α-ketoglutarat, ackumuleras under vissa förhållanden, och vid ett högt [NADH]/[NAD + ]-förhållande undertrycks båda dehydrogenasreaktionerna allvarligt. På liknande sätt är malatdehydrogenasreaktionen i cellen i strikt jämvikt (det vill säga den begränsas av substratet), och vid ett högt värde på [NADH]/[NAD + ]-förhållandet och en låg koncentration av oxaloacetat, första skedet av cykeln saktar ner. Ackumuleringen av produkter begränsar alla tre begränsande stadierna av cykeln: succinyl-CoA hämmar α-ketoglutaratdehydrogenas (liksom citratsyntas); citrat blockerar citratsyntas; slutprodukten, ATP, hämmar citratsyntas och isocitratdehydrogenas. ADP, en allosterisk aktivator av citratsyntas, minskar den hämmande effekten av ATP på detta enzym. Ca 2+ -joner i muskelvävnad hos ryggradsdjur , som fungerar som en signal för kontraktion och åtföljer ett ökat behov av ATP, aktiverar isocitratdehydrogenas och α-ketoglutaratdehydrogenas, såväl som pyruvatdehydrogenaskomplexet (PDH). Således bestämmer koncentrationen av substrat och intermediärer i trikarboxylsyracykeln ett sådant kolflöde genom det, vid vilket koncentrationerna av ATP och NADH som bildas kommer att vara optimala [22] .
Normalt är hastigheterna för glykolys och trikarboxylsyracykeln nära besläktade, så att endast en sådan mängd glukos omvandlas till pyruvat som förser cykeln med en tillräcklig mängd "bränsle" - acetylgrupperna i acetyl-CoA. Koncentrationer av pyruvat, laktat och acetyl-CoA hålls normalt konstanta. Glykolyshastigheten är relaterad till hastigheten för citronsyracykeln, inte bara genom hämning av glykolys genom höga nivåer av ATP och NADH, vilket är karakteristiskt för både glykolys och andningssteget av glukosoxidation, utan också genom citratkoncentration. Citrat, den första produkten i trikarboxylsyracykeln, är en viktig allosterisk hämmare av fosfofruktokinas-1 , ett glykolytiskt enzym [18] .
Den åttastegs cykliska processen för oxidation av en enkel acetyl-tvåkolsgrupp till CO 2 kan verka onödigt komplicerad och uppfyller inte den biologiska principen om maximal ekonomi . Rollen för trikarboxylsyracykeln är emellertid inte begränsad till oxidationen av acetatjonen (och följaktligen kolhydrater, fettsyror och vissa aminosyror, under oxidationen av vilka den bildas). Denna väg utgör kärnan i metabolismen av intermediärer. Slutprodukterna med fyra och fem kolatomer från många kataboliska processer går in i kretsloppet i mellansteg. Oxaloacetat och α-ketoglutarat, till exempel, är produkter av katabolismen av asparaginsyra och glutaminsyror , som bildas vid nedbrytning av proteiner. Många cykelmellanprodukter är involverade i vissa metaboliska processer och fungerar som prekursorer i många anabola processer. Således är trikarboxylsyracykeln en amfibolisk väg; den kopplar samman katabola och anabola processer [23] .
Pyruvat är en produkt av kolhydratoxidation. Vidare omvandlas pyruvat till acetyl-CoA och är involverat i trikarboxylsyracykeln. Dessutom är acetyl-CoA också en produkt av fettsyraoxidation, så trikarboxylsyracykeln är också involverad i fettkatabolism [24] . Det är värt att notera att pyruvat kan vara involverat i trikarboxylsyracykeln utan att omvandlas till acetyl-CoA, utan genom att omvandlas till malat under inverkan av ett äppelsyraenzym [25] .
Från α-ketoglutarat, bildat i trikarboxylsyracykeln, syntetiseras aminosyrorna glutamin , glutamat, prolin och arginin . Succinyl-CoA fungerar som en prekursor i syntesen av porfyriner och hem . Citrat är involverat i syntesen av fettsyror och steroler (acetyl-CoA bildas av citrat, dessutom fungerar det som en regulator [26] ). Malat kan transporteras från mitokondrierna till cytoplasman, där det omvandlas reversibelt till oxaloacetat. Det resulterande oxaloacetatet kan fungera som en prekursor för syntesen av aminosyrorna aspartat, asparagin , metionin , treonin och isoleucin , såväl som pyrimidiner . Det kan också omvandlas till fosfoenolpyruvat på bekostnad av GTP, och fosfoenolpyruvat (PEP) kan fungera som en prekursor i biosyntesen av fenylalanin , tyrosin , tryptofan , serin , glycin och cystein . Pyruvat, producerat av PEP under glykolys, kan bli en föregångare till alanin , leucin och valin , och kan också vara involverad i glukoneogenes [24] [25] .
Intermediärer av trikarboxylsyracykeln som har lämnat cykeln och är involverade i syntesen av olika föreningar ersätts av speciella anaplerotiska reaktioner . Under normala förhållanden är reaktionerna i vilka cykelintermediärer är involverade i andra metaboliska vägar och reaktionerna som ersätter deras avgång i dynamisk jämvikt, så koncentrationen av citronsyracykelintermediärer hålls konstant [25] .
Tabellen nedan visar de viktigaste anaplerotiska reaktionerna [25] :
| Reaktion | Enzym | vävnad/organism |
|---|---|---|
| pyruvat + HCO3 − + ATP ⇌ oxaloacetat + ADP + Fn | pyruvatkarboxylas | lever , njurar |
| fosfoenolpyruvat + CO 2 + BNP ⇌ oxaloacetat + GTP | fosfoenolpyruvatkarboxykinas | hjärta , skelettmuskler |
| fosfoenolpyruvat + HCO 3 − ⇌ oxaloacetat + F n | fosfoenolpyruvatkarboxylas | högre växter , jästsvampar , bakterier |
| pyruvat + HCO 3 − + NAD(P)H ⇌ malat + NAD(P) + | malik-enzym | brett spridd bland eukaryoter och bakterier |
I däggdjurslever och njure är den viktigaste anaplerotiska reaktionen den reversibla karboxyleringen av pyruvat för att bilda oxaloacetat, katalyserad av enzymet pyruvatkarboxylas . När det finns en minskning av oxaloacetat eller andra intermediärer i citratcykeln, karboxyleras pyruvat för att bilda ytterligare oxaloacetat. Den enzymatiska additionen av en karboxylgrupp till pyruvat kräver energi, som tas från ATP: den fria energin som krävs för att lägga till en karboxylgrupp till pyruvat är nästan lika med den fria energi som kan erhållas från ATP. Pyruvatkarboxylas är ett reglerande enzym och inaktiveras i frånvaro av acetyl-CoA, en positiv allosterisk modulator. När acetyl-CoA, "bränslet" för trikarboxylsyracykeln, finns i överskott, stimulerar det pyruvatkarboxylasreaktionen och främjar därigenom bildningen av oxaloacetat, vilket i sin tur gör det möjligt att involvera mer acetyl-CoA i trikarboxylsyracykeln. För genomförandet av pyruvatkarboxylasreaktionen krävs vitaminet biotin , som fungerar som en protetisk grupp av enzymet som bär CO 2 . Biotin måste finnas i människans kost, det finns i många livsmedel och syntetiseras av tarmbakterier [27] .
De andra anaplerotiska reaktionerna som anges i tabellen ovan kontrolleras också för att tillhandahålla en tillräcklig koncentration av mellanprodukter för att trikarboxylsyracykeln ska fungera. Till exempel aktiveras fosfoenolpyruvatkarboxylas av fruktos-1,6-bisfosfat, en glykolysmellanprodukt som ackumuleras under förhållanden med överskott av pyrodruvsyra [27] .
I växter och bakterier, under glyoxylatcykeln , kan acetyl-CoA omvandlas till succinat. Således kan dessa organismer utföra anaplerotisk nedbrytning av neutrala fetter (för mer information om glyoxylatcykeln, se nedan) [4] .
Det finns andra anaplerotiska sätt. Aminosyrorna histidin, prolin, arginin, glutamin och glutamat kan omvandlas till α-ketoglutarat och återställa dess koncentration; isoleucin, valin, metionin, tryptofan - till succinyl-CoA, aspartat, fenylalanin och tyrosin - till fumarat; aspartat och aspragin till oxaloacetat. Aminosyrorna alanin, serin, treonin, cystein och glycin kan omvandlas till pyruvat, vilket är nödvändigt för trikarboxylsyracykeln [24] .
Som nämnts ovan finns en ofullständig cykel av trikarboxylsyror i vissa anaeroba organismer. För dem tjänar det inte till att erhålla energi, utan att erhålla prekursorer för biosyntetiska processer. Dessa organismer använder de tre första reaktionerna i cykeln för att producera α-ketoglutarat, men eftersom de saknar α-ketoglutaratdehydrogenas kan de inte utföra alla omvandlingar av cykeln. De har dock 4 enzymer som katalyserar den sekventiella omvandlingen av oxaloacetat till succinyl-CoA, så att de kan bilda malat, fumarat, succinat och succinyl-CoA från oxaloacetat i reaktioner som är motsatsen till de "normala" (oxidativa) reaktionerna av cykeln. Denna väg är en fermentering , under vilken NADH, som bildas under oxidationen av isocitrat , omvandlas till NAD + genom reduktion av oxaloacetat till succinat [23] .
Hos växter , vissa ryggradslösa djur och vissa mikroorganismer (t.ex. jäst, Escherichia coli ), omvandlas acetyl-CoA till succinat genom glyoxylatcykeln , nära besläktad med trikarboxylsyracykeln. Den allmänna ekvationen för glyoxylatcykeln ser ut så här:
2 acetyl-CoA + NAD + + 2H2O → succinat + 2CoA + NADH + H +Det resulterande succinatet är vidare involverat i biosyntetiska processer. Hos växter är glyoxylatcykeln lokaliserad i speciella organeller , glyoxisomer [28] [4] .
Vissa bakterier är kapabla att utföra den omvända cykeln av trikarboxylsyror . Under denna process utförs reaktionerna i trikarboxylsyracykeln i motsatt riktning: där kolatomer kommer in i cykeln i form av acetyl-CoA och därefter oxideras till CO 2 , i omvänd cykel, tvärtom, acetyl -CoA släpps. För dess implementering behövs elektrondonatorer, och för dessa ändamål använder bakterier väte , sulfider eller tiosulfater . Andra enzymer i omvänd cykel än motsvarande framåtcykelenzymer inkluderar ATP-citratlyas , 2-oxoglutarat: ferredoxinoxyreduktas , pyruvatsyntas . Den omvända cykeln av trikarboxylsyror anses vara ett alternativ till fotosyntes genom bildning av kolhydrater [29] .
Trikarboxylsyracykeln är en vanlig väg för oxidation av acetylgrupper, till vilken praktiskt taget alla metaboliska vägar för levande organismer reduceras. Det är inte alls den kortaste vägen för oxidation av acetat till CO 2 , men det har genom naturligt urval visat sig ha de största fördelarna. Tidiga anaerober kan ha använt några av reaktionerna i trikarboxylsyracykeln i linjära biosyntetiska processer. Vissa moderna anaeroba mikroorganismer använder faktiskt en ofullständig cykel av trikarboxylsyror, inte som en energikälla, utan som en källa till prekursorer för biosyntetiska processer (för mer information, se avsnittet Modifieringar ). Tillsammans med utvecklingen av cyanobakterier , som bildar O 2 från vatten, blev jordens atmosfär aerob, och under påverkan av naturligt urval utvecklades aerob metabolism i organismer, mycket effektivare än anaerob jäsning [23] .
När de reglerande mekanismerna för vägar som trikarboxylsyracykeln störs, kan allvarlig sjukdom uppstå. Cykelenzymer kodas av hushållningsgener , och frånvaron av funktionella kopior av dessa gener kan förklaras av närvaron av vävnadsspecifika egenskaper hos cykeln [30] . Bland människor är mutationer som påverkar cykelenzymgener mycket sällsynta, men de som inträffar är skadliga.
Defekter i fumarasgenen leder till glatta muskeltumörer ( leiomyom ) och njurar ; mutationer i succinatdehydrogenas orsakar binjurecancer ( feokromocytom ) . Cellkulturer med sådana mutationer ackumulerar fumarat ( i fallet med fumarasmutationer) och, i mindre utsträckning, succinat (i fallet med succinatdehydrogenasmutationer), och denna ackumulering aktiverar den hypoxiinducerade transkriptionsfaktorn HIF -la . Utvecklingen av cancer kan vara en konsekvens av tillståndet pseudohypoxi. I celler med dessa mutationer finns ett ökat uttryck av gener som normalt regleras av HIF-1α. Sådana konsekvenser av mutationer i generna för fumaras och succinatdehydrogenas gör att de kan klassificeras som tumörsuppressorer [31] .
Sambandet mellan fumarasdefekter och störningar i nervsystemet har visats [32] .
Mutationer som förändrar aktiviteten av α-ketoglutaratdehydrogenas leder till ackumulering av aminosyranedbrytningsprodukter i urinen, vilket gör att urinen luktar lönnsirap . Denna sjukdom kallas leucinos ( Eng. Maple sirap urine disease ) [33] .
Flera föreningar och reaktioner av trikarboxylsyracykeln upptäcktes 1930 av Albert Szent-Györgyi , i synnerhet etablerade han rollen av fumarat, en nyckelkomponent i cykeln. För sina upptäckter tilldelades Szent-Györgyi Nobelpriset i fysiologi eller medicin 1937 [34] . Den fullständiga sekvensen av reaktioner och föreningar som bildades fastställdes 1937 av Hans Adolf Krebs, för vilken han fick Nobelpriset 1953 (tillsammans med F. Lipman) [35] (till hans ära fick trikarboxylsyracykeln ett av sina namn) . 1948 slog E. Kennedy och Albert Lehninger fast att i eukaryoter sker alla reaktioner i cykeln i mitokondrier [5] .
När den tunga kolisotopen 13 C och de radioaktiva isotoperna 11 C och 14 C blev tillgängliga för cirka 60 år sedan användes de för att spåra kolatomernas väg i trikarboxylsyracykeln. Ett av dessa experiment gav mycket oväntade resultat. Hydroxylmärkt acetat kombinerades med omärkt oxaloacetat för att bilda märkt citrat. Eftersom citrat är en symmetrisk molekyl, antogs det att det skulle omvandlas till α-ketoglutarat, bland vilket det skulle finnas molekyler märkta vid olika kolatomer. Men bara en "sort" av α-ketoglutaratmolekyler hade isolerats från celler, och forskarna drog slutsatsen att citrat och någon annan symmetrisk molekyl inte kunde vara en mellanprodukt på vägen från acetat till α-ketoglutarat; de föreslog att kondensation av acetat och oxaloacetat gav en osymmetrisk trikarboxylsyra, såsom cis -akonitat eller isocitrat . År 1948 fastställde Alexander Ogston prokiraliteten hos citrat (tendensen till asymmetriska reaktioner i frånvaro av ett kiralt centrum ), och förklarade därigenom resultaten av experiment och bekräftade att det är citrat som bildas i det första skedet av cykeln [36] .
För enklare memorering av syrorna som är involverade i Krebs-cykeln finns det en mnemonisk regel :
A Whole Ananas And A Slice Of Soufflé Today Actually My Lunch , som motsvarar serien - citrat, cis -akonitat, isocitrat, alfa-ketoglutarat, succinyl-CoA, succinat, fumarat, malat, oxaloacetat.
Det finns också följande mnemoniska dikt (dess författare är assistent vid Institutionen för biokemi vid KSMU E. V. Parshkova [37] ):
Gädda vid acetyl citronslam , Men påskliljan med en häst var rädd Han är isolimon över honom, men Alfa-ketoglutar als. Succinyl Xia koenzym , Amber ils fumar ovo, Apple ek sparade till vintern, Vände om gädda åh igen.(oxaloättiksyra, citronsyra, cis -akonitsyra, isocitronsyra, a-ketoglutarsyra, succinyl-KoA, bärnstenssyra, fumarsyra, äppelsyra, oxaloättiksyra).
En annan version av dikten:
Gäddan åt acetatet, det visar sig citrat via cis -aconitate kommer det att vara isocirat ger väte ÖVER, det förlorar CO2 väldigt glad över det alfa-ketoglutarat oxidation kommer: NAD kommer att stjäla väte B1 och lipoat med koenzym A i all hast, ta CO 2 och energin är knappt dök upp i succinyl omedelbart föddes gtf och succinat återstod. så han kom till FAD, som behöver väte förlorade väten, han blev bara ett fumarat. fumarat drack vatten, och det blev malat här kom jag att malate NAD, köpta väten Gäddan dök upp igen och gömde sig tyst Skydda acetatet...