Kosmider

Kosmider (Cosmides) - plasmider som innehåller ett DNA- fragment av lambdafagen inklusive cos -sektionen [1] . Tillsammans med förpackningssystem för fagpartiklar in vitro används de som vektormolekyler för genkloning och vid konstruktion av genomiska bibliotek. Kosmider konstruerades först av Collins och Brüning 1978 [2] . Deras namn kommer från förkortningen av två termer: cos -section (termen i sig kommer i sin tur från den engelska co hesive end s  - sticky ends) och plasmid .

Kosmider kan användas för att klona 32-47 kb DNA-segment. Plasmider, om du klona in dem DNA-sektioner större än 4-5 kb. bli instabil på grund av en ökande tendens att rekombinera . Dessutom förpackas kosmider i fagpartiklar, vilket gör att de kan levereras till bakterier med hjälp av transduktion .

Plot Cos

Cos- regionen består av ~200 baspar och krävs för att packa kosmiden till en fagpartikel. Den innehåller ett cosN-ställe där enzymterminaset bryter en enkelsträng av var och en av DNA-strängarna på ett avstånd av 12 bp. från varandra. Den cykliska kosmiden linjäriseras för att bilda 12 bp klibbiga ändar. (DNA måste vara linjärt för att komma in i huvudet på fagen). CosB -stället håller terminaset medan det skär DNA:t . CosQ -stället på nästa kosmid (eftersom replikering av rullande ring ofta leder till bildandet av konkatemerer ) bibehålls av terminaset efter att den föregående kosmiden har packats. Detta gör det möjligt att skydda linjära kosmider från klyvning av DNaser.

Kosmidernas struktur

I huvudsak är kosmiden DNA från lambdafagen , från vilken alla gener har tagits bort, förutom cos -stället. Kosmiden är cirka 5 kb stor.och inkluderar nödvändigtvis följande element: ett cos -ställe som krävs för packning i lambdafagvirioner , ett ursprung för replikation i en bakteriell eller eukaryotisk cell, restriktionsendonukleasigenkänningsställen och en markörgen (till exempel en gen för resistens mot något antibiotikum ) [3] .

Kosmider kan användas för att klona 32-47 kb DNA-segment. För att göra detta behandlas kosmiden och främmande DNA med samma restriktionsendonukleas, varefter de resulterande linjära fragmenten blandas och en ligeringsreaktion utförs. Därefter packas DNA:t i faghuvuden in vitro , det skärs i cos -ställen. De nödvändiga virala proteinerna erhålls från lysatet av E. coli cI857 ( röd - gam - Sam och Dam (huvud) och Eam (svans)). Denna process åtföljs av urvalet av fragment efter storlek, eftersom endast DNA med en längd på 78–105% av lambdafaggenomet kan förpackas. Sålunda kommer övervägande rekombinanta kosmider innehållande en klonad DNA-region att komma in i virionerna. Ligeringsprodukterna mellan två kosmider kommer att vara för små för packning, och mellan två fragment av främmande DNA kommer de att vara stora.

De resulterande fagpartiklarna med rekombinanta kosmider används för att infektera E. coli-celler. I cytoplasman cykliseras kosmider genom bindning med klibbiga ändar och verkan av enzymet ligas , och replikerar sedan som vanliga plasmider utan att uppvisa någon av egenskaperna hos en lambdafag. Urvalet av transformerade celler utförs enligt markörgenen som finns i vektormolekylen.

Ändringar

Eftersom kosmider gör det möjligt att klona relativt stora sektioner av DNA, är de lämpliga vektorer för att skapa bibliotek av eukaryota genomfragment erhållna genom partiell digestion med restriktionsendonukleaser . Produkterna från sådan klyvning kan dock vara av olika storlek, och det finns fall då två relativt små fragment som inte låg intill genomet ligeras och motsvarande klon skapas, vilket kommer att ge ett felaktigt intryck av deras position i kromosomerna . Detta problem kan övervinnas genom att fraktionera de partiella rötningsprodukterna efter storlek. Emellertid undviker inte ens denna metod helt uppkomsten av kosmidkloner som innehåller flera ligerade DNA-fragment, så andra metoder har föreslagits, i synnerhet defosforylering av främmande DNA-fragment så att de inte kan kombineras med varandra. Speciella kosmidvektorer pJB8 (Burke och Ish-Horowicz, 1981) och c2XB (Bates och Swift, 1983) har också skapats, med hjälp av vilka sannolikheten för bildandet av falska kloner minimeras.

Moderna kosmider av pWE- och sCos-serierna kännetecknas av närvaron av flera kloningsställen omgivna av fagpromotorer och unika igenkänningsställen av restriktionsendonukleaserna Not I, Sac II och Sfi I, som tillåter ett enzym att skära ut insättningen.

Anteckningar

1. ↑ Hohn Barbara, Murray Kenneth. Förpackning av rekombinanta DNA-molekyler till bakteriofagpartiklar in vitro   // Proc . Nati. Acad. sci. USA: tidskrift. - 1977. - August ( vol. 74 , nr 8 ). - P. 3259-3263 . - doi : 10.1073/pnas.74.8.3259 .
2. ↑ Collins John, Hohn Barbara.  Kosmider: en typ av plasmidgenkloningsvektor som kan paketeras in vitro i bakteriofag lambdahuvuden  // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America  : journal. - 1978. - 1 september ( vol. 75 , nr 9 ). - P. 4242-4246 . - doi : 10.1073/pnas.75.9.4242 .
3. ↑ Kosmider . Philip McClean. Hämtad 4 april 2014. Arkiverad från originalet 26 mars 2014. (obestämd)

Källor

• Primrose SB, Twyman RM, Old RW Principles of Gene Manipulation  (neopr.) . — 6:a. — Wiley-Blackwell , 2002. — ISBN 0632059540 .
• Griffiths AJF, Wessler SR, et al. En introduktion till genetisk analys  (neopr.) . — 8:a. — W. H. Freeman, 2004. - ISBN 978-0716749394 . Arkiverad 26 februari 2015 på Wayback Machine
• Bruce A. Voyles (2002) The biology of viruses 2nd ed. ISBN 0-07-237031-9
• Stryer, Lubert (1995) Biochemistry 4th ed. ISBN 0-7167-2009-4
• Eurekah Biosciences Collection: Viruses, @NCBI

Ordböcker och uppslagsverk	Britannica (online)