piRNA ( piwi- interagerande RNA, piRNA, piwiRNA , i vissa källor finns det som piRNA [1] ) är den största klassen av små icke - kodande RNA uttryckt i djurceller [2] ; de finns i komplex med proteiner från familjen Piwi , som de fick sitt namn för. piRNA är vanligtvis längre än miRNA och små störande RNA och har en längd på 26–32 nukleotider [3] , dessutom, till skillnad från miRNA, är de inte så konservativa [2] . Piwi-proteiner tillhör den stora gruppen av Argonaute- proteiner och uttrycks nästan uteslutande i könsceller ; de krävs för underhåll av stamceller , spermatogenes och förtryck av transposerbara element . Piwi-komplex med piRNA är inte bara involverade i tystnaden av retrotransposoner och andra genetiska element på posttranslationsnivån , utan har också några andra i stort sett obeskrivna effekter, till exempel epigenetiska [4] .
Det är fortfarande oklart hur piRNA bildas, men potentiella forskningsmetoder för denna fråga har föreslagits, och det har visat sig att vissa sätt att deras bildande skiljer sig från de för miRNA och små störande RNA. Samtidigt anses några små icke-kodande RNA från en annan grupp, rasiRNA , tillhöra piRNA [3] [5] .
Antalet detekterade piRNA är cirka 50 tusen i däggdjur och 13 tusen i Drosophila melanogaster [ 6] , vilket är betydligt fler än antalet kända små RNA från andra klasser. Eftersom en betydande del av piRNA, särskilt hos däggdjur, inte är associerad med transposerbara element, kan man anta att de även utför andra funktioner som ännu inte har beskrivits [3] .
piRNA upptäcktes 2006 [3] .
piRNA har hittats i både ryggradsdjur och ryggradslösa djur , och även om biogenesmönster och typer av interaktion med mål kan skilja sig åt mellan arter, finns det ett antal bevarade egenskaper som är gemensamma för alla piRNA. Inga uttalade motiv den sekundära strukturen [7] hittades i piRNA , deras längd är 26–32 nt, och i 80–90 % av fallen både hos ryggradsdjur och ryggradslösa djur är den första nukleotiden i 5'-änden uridin (U). Nematoden Caenorhabditis elegans har en fosfatgrupp i 5'-änden och 2'-O- metylering i 3' -änden [8] . Denna modifiering har också identifierats i Drosophila [9] , zebrafisk [10] , möss [11] och råttor [10] . En fosfatgrupp i 5'-änden finns också i piRNA från däggdjur [3] . Betydelsen av denna modifiering har ännu inte klarlagts, men det antas att den ökar stabiliteten hos piRNA [3] [10] .
Hos möss inkluderar Piwi-familjen tre proteiner: Mili, Miwi och Miwi2 [3] ; hos människor, HIWI (eller PIWIL1), HILI (eller PIWIL2), HIWI2 (eller PIWIL4) och HIWI3 (eller PIWIL3) [12] .
Hos däggdjur motsvarar cirka 17 % av piRNA- gener repetitiva sekvenser , inklusive transposerbara element. Det bör noteras att antalet piRNA som motsvarar upprepningar är mindre än andelen upprepningar i genomet . Hos gnagare är alltså dessa förhållanden 17 respektive ~42 %. Andra piRNA kodas av unika gener, med piRNA-kodande gener placerade i kluster i hela genomet. 90 % av sådana kluster finns i områden som inte innehåller kommenterade gener eller upprepningar, men ibland kan de finnas i introner och exoner [3] . Således, medan i D. melanogaster och ryggradsdjur dessa kluster är belägna i områden där proteinkodande gener saknas, i C. elegans är piRNA-gener placerade bland proteinkodande gener [5] [8] [13] . Varje sådant kluster kan koda från 10 till många tusen piRNA, och dess storlek kan variera från 1 till 100 kilobaser [14] . Ibland finns piRNA-kluster sida vid sida, men kodade av olika strängar; detta kan indikera dubbelriktad transkription från en gemensam promotor . Detektion och kortfattad annotering av piRNA-kluster i genom utförs med hjälp av bioinformatiska metoder , som blir mer och mer komplicerade [15] . Även om närvaron av piRNA-genkluster är mycket konserverad över arter , kan detsamma inte sägas för sekvenserna av dessa gener [16] . Till exempel, även om de största gnagar-piRNA-klustren har mänskliga ortologer , observeras inte sekvenslikhet i detta fall [3] .
Tidigare trodde man att hos däggdjur finns piRNA- och Piwi-proteiner endast i testiklarna [3] . Men vid det här laget har det fastställts att ett specifikt piRNA -system också finns i däggdjursägg [17] . Dessutom har det visats att en ytterligare Piwi-proteingen, PIWI-LIKE 3 (PIWIL3) , uttrycks i bovina oocyter under meios . Trots detta verkar piRNA från däggdjur endast fungera hos män [18] . Hos ryggradslösa djur har piRNA identifierats i både manliga och kvinnliga könsceller [10] .
På cellnivå har piRNA hittats i både kärnan och cytoplasman , vilket tyder på att piRNA kan fungera i båda [5] och därmed ha flera effekter [19] .
Uttrycksnivån för piRNA förändras under spermatogenesen. De börjar detekteras i pakyten ( profas I av meiotisk delning ) under delning av diploida spermatocyter genom meios (även om bildandet av piRNA börjar även i prepachytiserade celler [20] ), men under bildandet av haploida spermatider kommer innehållet av piRNA i dem sjunker kraftigt, och i mogna spermier saknas de, att döma av omkring, [3] .
Mekanismerna för piRNA-bildning är ännu inte helt klarlagda, även om flera möjliga mekanismer har föreslagits. I de fall där piRNA-gener faller in i exoner, motsvarar piRNA endast sens (sens-) mRNA -strängen , så de bildas från endast en DNA-sträng och är sannolikt derivat av långa primära prekursortranskript. Detta antagande överensstämmer med data om närvaron av testikelspecifika ESTs och mRNA som motsvarar piRNA loci . Dessutom hittades inga utvecklade sekundära strukturer som är karakteristiska för pri-miRNA i piRNA-klustren. Därför verkar piRNA- bearbetning vara annorlunda än mikroRNA och små störande RNA-bearbetning. Frånvaron av dubbelsträngade prekursorer, som är karakteristiska, i synnerhet för miRNA, bevisas av närvaron av endast senssekvenser i vissa unika piRNAs [3] .
Hos Drosophila och möss kan två steg särskiljas i piRNA-bearbetning: primär bearbetning och "pingpong"-cykeln (förstärkningsslinga) [20] .
Som nämnts ovan bildas piRNA från långa prekursortranskript. I Drosophila förkortas primära transkript till piRNA-liknande små RNA. Faktorerna som är involverade i denna process är fortfarande dåligt förstådda, men nyare studier har visat att det är möjligt att 5'-änden av sådana piRNA-liknande RNA bildas av Zucchini - endonukleas . Hos möss är homologen av zucchini MitoPLD-proteinet, som också har endonukleasegenskaper. Därefter binds piRNA-liknande RNA av Piwi-proteiner, varefter deras 3'-ände förkortas av ett ännu ej beskrivet endonukleas, och piRNA-liknande RNA får storlekar motsvarande primära piRNA. Det är möjligt att Hsp83/Shu-proteinkomplexet spelar en viktig roll vid laddning av piRNA på Piwi-proteiner. Vidare är piRNA 2'-O-metylerade av HEN1/Pimet-komplexet [20] .
PiRNA som har genomgått primär bearbetning är i ett tillstånd associerat med Piwi-proteiner. Sådana primära piRNA är antisens piRNA som är komplementära till transkript av transposerbara element. I Drosophila representeras Piwi-proteinfamiljen av tre proteiner: Piwi, Aubergine (Aub) och Ago3, men endast Piwi- och Aub-proteiner binder primära piRNA. Piwi-komplex med piRNA överförs till kärnan och deltar inte i "pingpong"-cykeln som förekommer i cytoplasman , utan deltar i nukleär tystnad. Aub-associerade piRNA binder transkript av mobila genetiska element komplementärt. Aub, liksom andra proteiner i Argonaute-gruppen, kan skära fosfodiesterbindningen i mål-RNA:t mittemot den 10:e och 11:e nukleotiderna i guide-RNA: n (i detta fall primära piRNA). Som ett resultat av brytningen bildas två fragment av det mobila elementets transkript, i ett av vilka 5'-änden är 10 nukleotider bort från 5'-änden av det primära piRNA:t. Detta fragment, ett sekundärt piRNA, till skillnad från primärt piRNA, är inte komplementärt till det mobila elementets transkript och är ett sense-piRNA. Eftersom oftast den första nukleotiden i primära piRNA är uridin, är adenin nukleotiden oftast belägen i den 10:e positionen från 5'-änden i sekundära piRNA . Mekanismen för bearbetning av 3'-änden av sekundära piRNA är fortfarande oklar. Det sekundära piRNA:t binder Ago3-proteinet och är inriktat på att klippa det primära piRNA-prekursortranskriptet, från vilket antisens-piRNA:t skärs ut. Sådana antisens-piRNA kan antingen tysta transposerbara element eller styra bildningen av nya sense-piRNA. Således kombinerar pingiscykeln piRNA-bearbetning och cytoplasmatisk tystnad av mobila element på transkriptionsnivå. Det gör det också möjligt att förbättra tystnad på grund av bildandet av nya antisens piRNAs som svar på ökat uttryck av transposerbara element [3] . I Drosophila kan "pingpong"-cykeln involvera inte bara primära piRNA, utan också piRNA som ärvts från modern. Drosophila pingiscykeln kallas heterotypisk eftersom den involverar 2 olika Piwi-proteiner, Aub och Ago3 [20] .
Hos möss binder primära piRNAs Mili- och Miwi-proteinerna, medan sekundära piRNA binder Miwi2-proteinet. Miwi-associerade piRNA är involverade i cytoplasmatisk tystnad, men deras mål är i stort sett okända. Mili-associerade primära piRNA är involverade i pingiscykeln. De sekundära piRNA som bildas i denna cykel binder till Miwi2, och piRNA-komplexet med Miwi2 skickas till kärnan, där det deltar i nukleär tystnad. Muspingiscykeln kallas homotypisk eftersom den involverar ett Piwi-protein, Mili. Proteinkomplexet HSP90/FKBP6 spelar en viss roll i bildandet av sekundära piRNA som binder till Miwi2. 2'-O-metylering av sekundära piRNA tillhandahålls av HEN1/Pimet-komplexet [20] .
I Drosophila, i somatiska celler i könskörtlarna (till exempel i follikelceller), uttrycks Piwi-proteiner också och binder till primära piRNA, men Aub- och Ago3-proteiner uttrycks här på en låg nivå, och de räcker inte för att bära ut "pingis"-cykeln [20] .
Tydligen finns en liknande mekanism för förtryck av mobila element hos zebrafisk [3] . Tecken på närvaron av "ping-pong"-mekanismen hittades i de mest primitiva djuren - svampar och cnidarians , vilket indikerar att "ping-pong"-mekanismen dök upp i de tidigaste grenarna av Metazoa och är en konservativ mekanism för förtrycket av mobila element [3] [21] .
Andra proteiner som inte tillhör Piwi-gruppen deltar också i piRNA-biogenes. I synnerhet är det några proteiner som tillhör Tudor-superfamiljen (TDRD). De innehåller Tudor -domänen , som säkerställer bindningen av TDRD-proteinet till ett annat proteinsubstrat på grund av närvaron av symmetriska eller asymmetriska dimetylargininrester i substratet. Piwi-proteiner har symmetriska dimetylargininrester nära N-terminalen , så TDRD- proteiner kan binda till dem och delta i RNA-tystnad . Från och med 2011 har 11 TDRD-proteiner som är involverade i piRNA-biogenes identifierats i Drosophila, och 7 sådana TDRD-proteiner har identifierats i möss [20] .
Till exempel visade sig flugor muterade i TDRD Tud-proteinet vara fenotypiskt överensstämmande med mutanter i Aub-proteinet. Tud-proteinet innehåller 11 Tudor-domäner och kan binda till både Aub och Ago3 via symmetriska dimetylargininrester, vilket fungerar som en "plattform" för "pingpong"-cykeln. I Tud-mutanter binder Aub- och Ago3-proteiner till piRNA mer aktivt än i vildtypsflugor , vilket orsakade avvikelser från den normala fenotypen [20] .
Flera proteiner är också kända som är involverade i piRNA-biogenes och inte är relaterade till varken Piwi- eller TDRD-proteiner. Således visades i Drosophila en sådan effekt för följande proteiner: Vasa (Vas), Maelstrom (Mael), Armi, Zuc, Squash (Squ) och Shu, som alla, med undantag för Squ, har homologer i möss. De flesta av dessa faktorer är involverade i "pingis"-mekanismen [20] .
Det har fastställts att C. elegans har piRNA, men saknar "pingpong"-mekanismen [22] . Nya studier av piRNA-biogenes hos C. elegans har dock delvis belyst frågan om hur exakt det piRNA-medierade försvarssystemet mot parasitära mobila element känner igen "själv" och "främmande", som immunsystemet [20] .
C. elegans piRNA är 21 nukleotider långa och kodas av två kluster på kromosom IV, belägna separat från de proteinkodande generna. På ett avstånd av ~42 nukleotider framför varje kluster finns CTGTTTCA-sekvensen, uppenbarligen nödvändig för transkriptionen av klustret av RNA-polymeras II. De syntetiserade piRNA binder till Piwi-proteinet PRG-1. De resulterande piRNA-komplexen med PRG-1 skannar efter främmande transkript och ofullständig komplementaritet (upp till 4 felmatchningar) är tillräcklig för att binda till transkriptet. och utlösa bildandet av RNA-beroende RNA-polymeraser, som säkerställer bildandet och amplifieringen av specifika små störande RNA (22G-RNA). De senare binder till WAGO-proteinet, ett C. elegans -specifikt protein från Argonaute -gruppen . I cytoplasman säkerställer dessa komplex gentystnad på mRNA-nivå, vilket förstör främmande transkript, medan de i kärnan blockerar transposerbara element på transkriptionsnivå [20] .
Erkännande av "egna" och "utländska" och skydd av egna utskrifter från förstörelse, uppenbarligen, utförs på flera nivåer:
För förmågan att tysta mobila element och skydda genomet från dem har piRNA kallats "väktare av genomet" [20] . Tydligen, hos däggdjur, är aktiviteten av piRNA för transposontystnad särskilt viktig under utvecklingen av embryot , dessutom är både människor och C. elegans nödvändiga för spermatogenes [23] [24] . Mutationer som stör det piRNA-medierade tystnadssystemet av transposerbara element i hanmöss minskar fertiliteten eller leder till och med till sterilitet [3] [25] . Det är också möjligt att vissa sjukdomar i det mänskliga reproduktionssystemet, såsom azoospermi, orsakas av defekter i piRNA-systemet [20] .
Viss verkan av piRNAs på vissa metyltransferaser , som utför metylering som är nödvändig för att känna igen och tysta transposoner, har noterats, men detta förhållande är fortfarande dåligt förstått [23] .
piRNA kan överföras från modern, och epigenetiska effekter av sådant moderärv har visats i Drosophila [13] . Aktiviteten hos specifika piRNA i epigenetiska processer kräver också interaktion av piRNA med Piwi-proteiner, HP1a och andra faktorer [6] . Det är möjligt att piRNA är involverade i den epigenetiska regleringen av karcinogenes [20] .
I snäckan Aplysia ( havshare ) har det visats att piRNA som finns i CNS - neuroner undertrycker uttrycket av CREB2 -genen, en minnesrepressor , genom att inducera DNA-metylering i dess region och därigenom säkerställa minnets funktion . Dessutom har piRNA nyligen hittats i mushippocampala neuroner . Förmodligen är dessa piRNA involverade i bildandet av dendritiska ryggraden [20] .
De största framstegen i studiet av piRNA har uppnåtts med hjälp av specifika sekvenseringstekniker som Solexa och 454. Med dessa kan heterogena och komplexa RNA-populationer som piRNA analyseras. Den lilla storleken på dessa RNA skapar vissa svårigheter i deras artificiella uttryck och amplifiering , men för att övervinna dem har speciella tekniker utvecklats baserade på polymeraskedjereaktionen [26] [27] .
| Typer av RNA | |
|---|---|
| Proteinbiosyntes | |
| RNA-bearbetning |
|
| Reglering av genuttryck |
|
| cis-reglerande element | |
| Parasitiska element | |
| Övrig |
|
| Nukleinsyratyper _ | ||||
|---|---|---|---|---|
| Kvävehaltiga baser | ||||
| Nukleosider | ||||
| Nukleotider | ||||
| RNA | ||||
| DNA | ||||
| Analoger | ||||
| Vektortyper _ |
| |||
| ||||