Fluorescerande in situ hybridisering

Fluorescens in situ hybridisering , eller FISH-metoden ( fluorescence in situ hybridization-FISH ), är en cytogenetisk  metod som används för att detektera och bestämma positionen för en specifik DNA-sekvens på metafaskromosomer eller i interfaskärnor in situ . Dessutom används FISH för att detektera specifika mRNA i ett vävnadsprov . I det senare fallet gör FISH-metoden det möjligt att fastställa spatiotemporala egenskaper hos genuttryck i celler och vävnader.

FISH-metoden används vid preimplantation , prenatal och postnatal genetisk diagnostik [1] , vid diagnos av onkologiska sjukdomar [2] , i retrospektiv biologisk dosimetri [3] .

Sonder

Fluorescens in situ hybridisering använder DNA-sonder (DNA-sonder) som binder till komplementära mål i provet. DNA-sonder innehåller nukleosider märkta med fluoroforer (direkt märkning) eller konjugat såsom biotin eller digoxigenin (indirekt märkning). Med direkt märkning kan DNA-sonden bunden till målet observeras med ett fluorescensmikroskop omedelbart efter att hybridiseringen är avslutad . Vid indirekt märkning krävs ytterligare ett färgningsförfarande, under vilket biotin detekteras med fluorescensmärkt avidin eller streptavidin, och digoxigenin med fluorescensmärkta antikroppar . Även om den indirekta varianten av DNA-sondmärkning kräver ytterligare reagens och tidskostnader, gör denna metod det vanligtvis möjligt att uppnå en högre signalnivå på grund av närvaron av 3–4 fluorokrommolekyler på en antikropp eller avidinmolekyl. Dessutom, vid indirekt märkning, är kaskadförstärkning av signalen möjlig [4] .

För att skapa DNA-sonder används klonade DNA-sekvenser (till exempel Noi I-bindande kloner av den 3:e humana kromosomen , BAC kloner) [5] [6] , genomiskt DNA, PCR - produkter , märkta oligonukleotider , samt DNA, erhållet genom mikrodissektion [4] .

Märkning av sonden kan utföras på olika sätt, till exempel genom nick-translation eller genom PCR med märkta nukleotider .

Hybridiseringsprocedur

Det första steget är designen av sonderna. Sondstorleken bör vara tillräckligt stor för att hybridisering ska ske vid ett specifikt ställe, men inte för stor (inte mer än 1 kb) för att inte störa hybridiseringsprocessen. Vid identifiering av specifika loci eller vid färgning av hela kromosomer är det nödvändigt att blockera hybridiseringen av DNA-sonder med icke-unika repetitiva DNA-sekvenser genom att lägga till omärkta DNA-upprepningar (till exempel Cot-1 DNA ) till hybridiseringsblandningen. Om DNA-proben är dubbelsträngat DNA måste den denatureras före hybridisering.

I nästa steg förbereds preparat av interfaskärnor eller metafaskromosomer. Celler fixeras på ett substrat, vanligtvis ett objektglas, följt av DNA-denaturering . För att bevara morfologin hos kromosomer eller kärnor utförs denaturering i närvaro av formamid , vilket gör det möjligt att sänka denatureringstemperaturen till 70 °C.

Därefter tillsätts prober till beredningen och hybridisering utförs under cirka 12 timmar. Tillbringa sedan flera steg av tvättar för att ta bort alla icke-hybridiserade prober.

Visualisering av bundna DNA-sonder utförs med användning av ett fluorescerande mikroskop. Intensiteten hos den fluorescerande signalen beror på många faktorer - probens märkningseffektivitet, typen av sond och typen av fluorescerande färgämne.

Se även

RGEN-ISL Molekylär avbildningsmetod med RNA-riktat endonukleas CRISPR/dCas9 associerat med en märkning. Till skillnad från klassisk fluorescerande in situ-hybridisering kräver RGEN-ISL inte DNA-denaturering och ger därför bättre bevarande av kromatinstrukturen.

Anteckningar

1. ↑ Shilova N. V., Zolotukhina T. V. Interfasfluorescerande in situ-hybridisering vid diagnos av numeriska kromosomavvikelser // Medicinsk genetik. - 2007. - T. 6. - Nr 10. - S. 53-58.
2. ↑ Överbrygga JA, Cushman-Vokoun AM . Molecular diagnostics of soft tissue  tumors (neopr.)  // Archives of Pathology & Laboratory Medicine . - 2011. - Maj ( vol. 135 , nr 5 ). - S. 588-601 . - doi : 10.1043/2010-0594-RAIR.1 . — PMID 21526957 .
3. ↑ Ainsbury EA, Bakhanova E., Barquinero JF et al. Genomgång av retrospektiv dosimetriteknik för exponering för extern joniserande strålning  // Radiation Protection Dosimetry  : journal  . - 2011. - November ( vol. 147 , nr 4 ). - s. 573-592 . doi : 10.1093 / rpd/ncq499 . — PMID 21183550 . Arkiverad från originalet den 20 november 2015.
4. ↑ 1 2 Rubtsov N. B. Metoder för att arbeta med däggdjurskromosomer: Proc. bidrag . - Novosibirsk : Novosib. stat un-t , 2006. - 152 sid. — ISBN 5-94356-376-8 . Arkiverad 2 april 2015 på Wayback Machine
5. ↑ Sazanov AA, Sazanova AL, Stekol'nikova VA, Kozyreva AA, Romanov MN, Malewski T., Smirnov AF Kromosomal lokalisering av sju HSA3q13→q23 NotI länkande kloner på kycklingmikrokromosomer: ortologi av GGA14 och GGA15 till en genrik region HSA3  (engelska)  // Cytogenetic and Genome Research : tidning. - Basel , Schweiz : Karger Publishers , 2005. - Vol. 111, nr. 2 . - S. 128-133. — ISSN 1424-8581 . - doi : 10.1159/000086381 . — PMID 16103653 . Arkiverad från originalet den 15 mars 2015.  (Tillgänglig: 15 mars 2015)
6. ↑ Sazanov AA, Romanov MN, Sazanova AL, Korczak M., Stekol'nikova VA, Kozyreva AA, Smirnov AF, Jaszczak K., Dodgson JB Kromosomal lokalisering av 15 stora insatta BAC-kloner innehållande tre mikrosatelliter på kycklingkromosom 4 som (GGA4) förfina sin centromerposition  // Animal Genetics  : journal  . - Oxford , Storbritannien : International Society for Animal Genetics; Blackwell Publishers Ltd , 2005. Vol. 36, nr. 2 . - S. 161-163. — ISSN 0268-9146 . - doi : 10.1111/j.1365-2052.2004.01225.x . — PMID 15771730 . Arkiverad från originalet den 2 april 2015.  (Tillgänglig: 15 mars 2015)

Litteratur

• Rubtsov N.B. In situ hybridisering av nukleinsyror vid analys av kromosomavvikelser // Molekylärgenetiska metoder vid diagnos av ärftliga och onkologiska sjukdomar. Introduktion till molekylär diagnostik / Ed. M.A. Paltseva, D.V. Zaletaeva. - M .: Medicin , 2011. - T. 2. - S. 100-136. - 1000 exemplar.  - ISBN 978-5-225-03557-0 .

Ordböcker och uppslagsverk	stor kines stor kines Britannica (online)