Riboswitch [1] ( eng. riboswitch ) är ett element i den 5'-otranslaterade regionen (5'-UTR) av mRNA . Det utför cis -reglering av mRNA:t på vilket det är lokaliserat genom att binda till ligander - en mängd olika små molekyler , till exempel kobamamid , tiaminpyrofosfat , lysin , glycin , flavinmononukleotid , guanin , adenin och andra. En typisk riboswitch inkluderar två huvuddomäner : en aptamerisk domän som känner igen och binder till en ligand, och en expressionsplattform som interagerar med transkriptions- eller translationsproteiner. Aptamerdomänen och expressionsplattformen överlappar varandra i området för den så kallade switchningssekvensen, som är ansvarig för att vika RNA till två ömsesidigt exklusiva sekundära strukturer , på grund av vilken reglering utförs.
Riboswitchar har identifierats i representanter för alla tre livsdomäner , såväl som i vissa virus [2] [3] .
Många bakterier kan antingen transportera de nödvändiga små molekylerna från miljön eller syntetisera dem själva från enkla prekursorer. Var och en av dessa processer kräver en annan uppsättning proteiner , och bakterier använder ofta en återkopplingsmekanism för att kontrollera produkterna från tidigare enzymatiska steg: ett överskott av den önskade produkten hämmar antingen sin egen syntes eller aktiverar efterföljande enzymatiska steg. Vanligtvis övervakas nivån av cellulära metaboliter av speciella proteiner som interagerar med DNA eller RNA och reglerar syntesen av motsvarande enzymer. Av denna anledning, när undertryckandet av gener för biosyntesen av vitamin B 1 , B 2 och B 12 av sådana föreningar som tiamin , riboflavin respektive kobalamin upptäcktes, inriktades huvudinsatserna på sökandet efter lämpliga repressorproteiner som spåra nivån av dessa föreningar. Emellertid har inga sådana hypotetiska modulatorer hittats. Dessa resultat uppmärksammade den möjliga reglerande rollen för konserverade mRNA-sekvenser ("lådor") och gav det djärva förslaget att det är möjligt att nivån av dessa vitaminderivat övervakas direkt av RNA. Dessutom, 1998, visade Grundy och Henkin [4] att Salmonella typhimurium cob mRNA-ledarregionen har signifikant olika konformationer i närvaro och frånvaro av adenosylkobalamin (AdoCbl). Försök att direkt testa bindningen av kobalamin till mRNA har dock inte varit framgångsrika. Liknande resultat erhölls med Escherichia coli btuB- mRNA : tillsatsen av AdoCbl fick omvänt transkriptas att stoppa nära 3'-änden av mRNA-ledarregionen under in vitro primerförlängning , vilket tydligen indikerar stabilisering av denna region vid bindning till metaboliten [5] .
Slutligen har tre vitaminderivat, tiaminpyrofosfat (TPP), flavinmononukleotid (FMN) och AdoCbl, visats interagera direkt med sina respektive mRNA för att kontrollera vitamin B 1 , B 2 och B 12 -operoner . Dessa rapporter har visat att metabolitbindning stabiliserar konformationen av en evolutionärt konserverad RNA-sensor (naturlig aptamer) och inducerar veckningen av icke-konserverade nedströms RNA-regioner till en struktur som påverkar transkriptionsterminering eller translationsinitiering . Således orsakar direkt bindning av metaboliten till RNA mRNA "riboswitch" mellan alternativa konformationer, vilket påverkar genuttrycket [5] . Termen "riboswitch" föreslogs 2002 av Breaker och kollegor [4] .
Sedan upptäckten av de första vitaminspecifika riboswitcharna har många andra typer av riboswitch upptäckts. Hittills har det fastställts att riboswitch kan svara på puriner och deras derivat, proteinkoenzymer och relaterade föreningar, aminosyror och fosforylerade sockerarter . Vissa riboswitchar reagerar specifikt på oorganiska ligander, inklusive metaller ( Mg 2+ joner ) , som attraheras till den negativt laddade sockerfosfatryggraden i RNA och till negativt laddade fluoranjoner [ 5] .
Funktionellt och strukturellt kan två domäner urskiljas i riboswitchar. Den första av dessa, aptamerdomänen, är ansvarig för ligandbindning och bildar en ligandbindande ficka lämplig för en viss ligand. Den andra domänen, känd som expressionsplattformen, innehåller ett sekundärt strukturväxlingselement som interagerar med transkriptionella och translationella regulatoriska proteiner. Aptamer-domänen och uttrycksplattformen överlappar varandra i området för växlingssekvensen, som utför den reglerande funktionen. Växlingssekvensen styr förändringen av två ömsesidigt exklusiva strukturer av uttrycksplattformen, som motsvarar "på" och "av" tillstånden för mRNA [2] .
Trots den enorma variationen av riboswitch-ligander, syftar den reglerande aktiviteten av de allra flesta bakteriella riboswitch till att förändra transkriptionen eller translationen av gener som är ansvariga för transporten och syntesen av denna metabolit. Denna regulatoriska aktivitet är baserad på det faktum att, beroende på närvaron av en ligand, kan RNA anta två ömsesidigt uteslutande konformationer. I fallet med transkription fungerar sådana strukturer som Rho -oberoende terminator eller anti-terminator hårnålar . I fallet med translation inkluderar ligandberoende omarrangemang utåt eller inåt packning av ribosombindningsställen ( riosombindningsställe , RBS ) eller Shine -Dalgarno-sekvensen ( SD ) . Nyligen genomförda studier har visat att riboswitch kan förmedla Rho-beroende transkriptionsterminering. Denna regleringsmekanism verkar vara utbredd, eftersom ett antal riboswitchar saknar Rho-oberoende terminatorer eller hårnålar som tar bort RBS eller SD inuti molekylen [5] .
Ett ovanligt regleringssätt använder glmS ribozyme ribozyme , som säkerställer att mRNA:t klyvs efter bindning till metaboliten. Detta icke-kodande RNA finns vanligtvis i Gram-positiva bakterier och interagerar med glukosamin -6-fosfat (GlcN6P), som, efter bindning till glmS mRNA , skär det vid riboswitchen. RNas J bryter sedan ned klyvningen med början vid 5'-OH-änden och förhindrar därigenom translation av glmS-mRNA . Riboswitch-ribozym glmS bryter den traditionella uppfattningen att en riboswitch bara känner igen en förening: denna riboswitch kan binda till en rad besläktade föreningar och kan därför tjäna till att bedöma en cells övergripande metaboliska status [5] [4] .
Vissa riboswitchar kan vara involverade i olika regulatoriska processer. Cyklisk diguanosyl-5'-monofosfat (c-di-GMP), en andra budbärare , utlöser ett antal fysiologiska förändringar, och dess motsvarande riboswitch finns bredvid gener som är involverade i cellmotilitet, virulens och andra processer. Vissa riboswitchar som fungerar med c-di-GMP är placerade nära självskarvande grupp I-introner . Dessa RNA-regulatorer fungerar genom en komplex kaskad av händelser som kräver deltagande av båda regulatoriska regioner av RNA. c-di-GMP binder till sin aptamer och inducerar en veckförändring som gör att GTP kan attackera 5'-änden av intronet . Som ett resultat skärs intronet ut och RBS-regionerna som är avlägsna från varandra närmar sig varandra och bildar mRNA som kan translation. Denna kombinerade allosteriska interaktion mellan de två RNA-regionerna resulterar i ett tvåpunktskontrollsystem som känner igen koncentrationerna av både c-di-GMP och GTP och utlöser splitsning. Denna hypotes kräver experimentell bekräftelse [5] .
Efter upptäckten av riboswitch föreslogs det att dessa typiska cis -regulatoriska element också kan fungera som transregulatoriska element . Detta verkar vara sant åtminstone för S-adenosylmetionin (SAM) riboswitcharna SreA och SreB Listeria monocytogenes . Efter SAM-beroende avslutning av transkription binder dessa riboswitchar komplementärt till den 5'-otranslaterade regionen (5'-UTR) av mRNA som kodar för PrfA-virulensfaktorn och undertrycker dess uttryck på translationsnivå [5] .
I eukaryoter kräver frikopplingen av transkription och translation, såväl som närvaron av introner, deltagande av olika mekanismer för reglering av genuttryck. Riboswitchar för eukaryota tiaminpyrofosfat (TPP) påverkar inte transkription och/eller translation, utan alternativ splitsning . "Normal" splitsning inträffar när ett ställe inom en riboswitch beläget i ett intergeniskt ställe eller 3'-UTR- par komplementärt med ett ställe som sträcker sig över ett av skarvningsställena. Detta sker i frånvaro av TRR. Produkten som erhålls efter splitsning översätts till ett komplett protein. När TPP är närvarande i en cell vid en tröskelkoncentration binder det till riboswitchen, vilket gör att en hittills gömd skarvningsplats kommer till ytan och blir tillgänglig för skarvningsapparaten. Beroende på art innehåller det alternativt splitsade mRNA:t interna stoppkodon som antingen leder till translation av fel peptid (filamentösa svampar ) eller till för tidig avslutning av translation ( gröna alger ). I högre växter resulterar alternativ splitsning i transkript med för långa 3'-UTR, vilket destabiliserar dem [5] . Ibland kan riboswitchar reglera både transkription och translation. SAM-I-riboswitchen svarar på förändringar i svavelkoncentrationen med bildandet av antisens-RNA , men detaljerna i den reglerande processen är fortfarande okända [4] .
Även om välbeskrivna eukaryota riboswitchar endast hänvisar till TPP-beroende system, har en nyligen genomförd studie visat närvaron av adenosinbindande RNA-aptamerer i ryggradsdjursgenom . Den biologiska rollen för dessa RNA studeras fortfarande. Vissa eukaryota mRNA kan svara på miljöförändringar genom att byta från en av de alternativa konformationerna till en annan, liknande riboswitches. Till exempel, som svar på signaler från interferon-y och hypoxi , sker en RNA-switch i 3'-UTR-mRNA från vaskulär endotelial tillväxtfaktor -A (VEGF), vilket påverkar translationen av VEGF i myeloidceller . Men förändringen i konformation i detta fall är inte associerad med metaboliten, utan med proteinbindning som svar på en extern stimulans [5] .
Riboswitchar fungerar inte alltid som enstaka regulatoriska enheter. Två sensoriska domäner eller hela riboswitchar (i fallet med så kallade tandem-riboswitchar) ligger ibland intill varandra. Till exempel består många glycinriboswitchar av två glycinsensorer åtskilda av en kort länkinsats och kan anta en mycket komplex tertiär struktur. Även om de två sensoriska domänerna kan hjälpa varandra att vika och binda till en ligand, har det biologiska syftet med en sådan duplicering ännu inte entydigt fastställts. Den biologiska rollen för tandemriboswitchar med olika specificiteter är tydligare. De modulerar genuttryck endast när alla nödvändiga metaboliter finns i cellen. Regulatoriska vägar förmedlade av riboswitch kan inkluderas i andra, ännu mer komplexa system för reglering av genuttryck. Till exempel fungerar L. monocytogenes SAM-riboswitchar endast vid temperaturer som tillåter infektion, när den intilliggande RNA-termometern ändrar sin konformation och smälter. Ett annat exempel är användningen av Enteroccus faecalis etanolamin , där AdoCbl-riboswitchen verkar i samband med ett regulatoriskt protein som påverkar stabiliteten hos transkriptionsterminatorer [5] .
Riboswitcharnas exceptionella selektivitet beror helt på konservatismen hos deras sensordomäner. Ligandigenkänningsställen varierar mycket i storlek och komplexitet hos sekundära och tertiära strukturer . För alla huvudklasserna av riboswitchar, såväl som vissa underklasser, erhölls strukturer av sensoriska domäner i kombination med motsvarande ligander, strukturer med hög upplösning erhölls. Även om riboswitchar har väldigt olika konformationer (endast närbesläktade purinriboswitchar visar viss likhet), innehåller strukturen hos de flesta riboswitchar multihelix-övergångar och ribozymliknande pseudoknoter . Av denna anledning kan de flesta av riboswitcharna delas in i två typer beroende på strukturen: den första typen inkluderar riboswitchar, vars struktur representeras av anslutningar av flera spiraler (”anslutande” riboswitchar), och den andra typen inkluderar riboswitchar med pseudoknoter i strukturen [5] .
"Anslutande" riboswitchar kan delas in i två undertyper, beroende på platsen för nyckelövergången där P1-regleringshelixen är inblandad. Den täcker sensordomänen och innehåller som regel en region som gör att den kan ansluta till olika strukturella element. I riboswitchar av typ Ia intar den multiheliska förbindelsen en central position och förbinder de återstående helixarna med P1-helixen, som i regel deltar i många interaktioner som stabiliserar molekylens tertiära struktur. Detta är vad som händer i purin- och TPP-riboswitchar. En av spiralerna kan vara mycket längre än de andra och kan böjas till multihelixen, där den bildar tertiära interaktioner; så här är lysinriboswitchen ordnad - en av de största riboswitcharna som beskrivs [2] . Metabolitbindande fickor bildas inom eller nära multicoil-övergången, så att RNA-bindning till liganden direkt påverkar stabiliteten av hela multicoil-övergången och P1-helixen [5] .
Riboswitchar av den andra typen (Ib) kännetecknas av den "omvända" arkitekturen av anslutningarna, i vilken den multiheliska nyckelanslutningen är förpassad till molekylens periferi och är belägen långt från P1-helixen. Helixen som utgår från korsningen böjer sig mot P1 och stabiliserar den genom tertiära interaktioner på lång räckvidd. Metaboliter binder till RNA vid korsningen och/eller nära P1, vilket påverkar dess bildning genom stabilisering av den övergripande konformationen och tertiära interaktioner. Typiska representanter för klass Ib är tetrahydrofolat (THF) och magnesiumriboswitch [5] .
Subtyp II inkluderar sådana riboswitchar som SAM-II- och fluorriboswitchar, vars strukturer helt representeras av små pseudoknoter. Det är värt att betona att pseudoknots är viktiga delar av vissa "anslutande" riboswitchar, de kan vara involverade i bildandet av metabolitbindande fickor, som i fallet med glmS riboswitch-ribozym , såväl som bildandet av långväga tertiära bindningar, som i SAM-I riboswitch [5] .
Det blir tydligt att strukturen hos riboswitchen och liganden inte är relaterade till varandra. Dessutom, i de tre klasserna av riboswitchar som känner igen SAM, finns det olika anslutande strukturella element och pseudo-knutar. Förutom spiraler och pseudoknoter inkluderar strukturella beståndsdelar som ofta finns i riboswitch K-sväng ( knäcksväng, K-sväng ), kyssslinga-interaktioner, sarcin-ricin-slingor och T-slingor [2] . Detta visar den fantastiska förmågan hos RNA att anta olika konfigurationer för att känna igen samma ligand. Det är värt att notera att många riboswitchar innehåller repetitiva strukturella motiv som finns i andra naturliga och artificiella RNA. Liksom andra funktionella RNA, använder riboswitch dessa motiv som grundläggande byggstenar för att konstruera komplexa rumsliga strukturer [5] .
Riboswitchar kan känna igen ligander av en mängd olika kemiska egenskaper och delar inte några gemensamma egenskaper som gör att de kan binda till metaboliter. Det finns dock ett antal gemensamma drag i bindningen av ligander med riboswitchar. De flesta riboswitchar bildar stela bindningsfickor som är idealiska för att binda delar av igenkännbara ligandstrukturer, och små ligander passar helt och hållet i sådana fickor. Ligandbindning orsakar strukturella förändringar i riboswitch [2] . Fickor är vanligtvis omgivna av konserverade nukleotider och icke-kanoniska baspar arrangerade i en förlängd oregelbunden helix eller konvergerande helixar. Med några få undantag använder de flesta ligander heteroatomer för att bilda specifika vätebindningar och elektrostatiska interaktioner med RNA. Ofta bildas specifika vätebindningar mellan ändarna av ligander och konserverade felmatchade RNA-nukleotider (t.ex. G40 i en aminopurinsensor). Plana grupper av ligander deltar som regel i staplingsinteraktioner och är inklämda mellan RNA-puriner. Metalljoner såsom Mg 2+ och K + kan kompensera för den negativa laddningen av liganden eller dess funktionella grupper såsom fluorid- , karboxyl- och fosfatrester . Metalljoner är också involverade i ligand-RNA-interaktioner genom direkt eller vattenmedierad koordination. Alla dessa egenskaper har visats i komplex av riboswitches och deras korrekta ligander med röntgendiffraktionsanalys av riboswitches som inte är associerade med ligander, såväl som riboswitches associerade med de korrekta liganderna eller liganderna som är mycket lika de korrekta. Dessa studier drog slutsatsen att riboswitch binder till sina korrekta ligander genom att använda en kombination av "konformationellt urval" och inducerade formmekanismer. Riboswitchar särskiljer liknande anslutningar främst på grund av rumsliga inkonsekvenser, såväl som bildandet av specifika interaktioner. De flesta riboswitchar är mycket specifika. Till exempel når skillnaden i bindningen av en purinriboswitch till adenin och guanin 10 000 gånger, och lysinriboswitchen känner igen lysin och ornitin , som är mycket lika i struktur, med en skillnad på 5 000 gånger [2] . Intressant nog kan riboswitchar av samma klass riktas mot att känna igen olika koncentrationer av samma metabolit. De kan också skilja sig åt i termodynamiska och kinetiska parametrar, med andra ord, de kan skilja sig åt i närvaro av jämvikt mellan RNA och naturlig ligand [5] .
Ursprunget och utvecklingen av riboswitch är ett av de mest spännande problemen i studien av RNA. In vitro-experiment har visat att RNA kan anpassa sig till ligandbindning relativt lätt, så det tar relativt lite tid för naturligt urval att förvandla RNA-sekvenser till metabolitbindande domäner. Mindre vanliga riboswitchar kan ha dykt upp sent i evolutionens gång. Flera av dessa händelser kan ge upphov till oberoende klasser av riboswitchar specifika för samma anslutning, såsom SAM. Samtidigt vittnar närvaron av TPP-riboswitchar i livets alla tre domäner om det gamla ursprunget för denna typ av riboswitchar och deras motståndskraft mot evolutionärt tryck. Enligt RNA-världshypotesen fungerade RNA vid något tillfälle som både en bärare av genetisk information och en katalysator för kemiska reaktioner. Den katalytiska förmågan hos glmS riboswitch-ribozym , liksom förmågan hos riboswitch att interagera med "urgamla" koenzymer som FMN, TPP och SAM, som förmodligen var utbredda i de tidigaste biokemiska reaktionerna, tyder på att molekyler som riboswitch var verktyg som säkerställer existensen och utvecklingen av den primära världen av RNA. Det är troligt att riboswitch var de reglerande delarna av RNA-världen. Riboswitchar har överlevt till denna dag, kanske för att de har skapat en nisch av metabolisk reglering som är mer lämpad för RNA än för proteiner. Samtidigt är reglering med hjälp av riboswitch mer energikrävande, eftersom dess implementering kräver syntes av mRNA från den reglerade genen. Samtidigt kräver reglering med hjälp av riboswitchar färre mellansteg än reglering med hjälp av speciella proteiner [5] [2] .
Baserat på principerna för drift av riboswitchar utvecklas nya, konstgjorda genetiska switchar. Det är till exempel möjligt att modifiera aptameren och få ett nytt kontrollelement som känner igen de ämnen som forskaren behöver. En konstgjord riboswitch har utvecklats som inte bara känner igen det nödvändiga elementet, utan också skär sig själv, det vill säga den har ribozymaktivitet. Denna konstruktion kallades "aptazim", den kan användas inom medicin för att självskära viralt mRNA i cellen och följaktligen undertrycka uttrycket av virusgener [6] . Riboswitchar kan också hitta tillämpning i genterapi [7] . Dessutom kan riboswitchar vara mycket användbara i studiet av bakteriebiologi, till exempel som ett verktyg för att skapa artificiella mekanismer för genuttryck [8] [9] . En annan riktning i utvecklingen av artificiella ribozymer är skapandet av biosensorer som, som svar på bindning till ligander, avger något detekterbart resultat, till exempel en elektrokemisk signal eller fluorescens [4] [10] . Fluorescerande riboswitchar har utvecklats som gör det möjligt att visualisera förändringar i metabolitkoncentrationer i bakterieceller [11] .
Under 2016 rapporterades skapandet av "termiska switchar" - integrationen av temperaturkänsliga RNA-termometrar och riboswitch-aptamerer i en enda struktur. Termiska switchar fungerar som riboswitchar vid låga temperaturer och reagerar på bindning med sin ligand genom att ändra strukturen, och vid höga temperaturer går de in i ett permanent "på" tillstånd. Sådana artificiella RNA-regulatorer kan användas i stor utsträckning för att reglera genuttryck [4] .
Riboswitchar anses vara ett lovande mål för utvecklingen av nya antibiotika . Till exempel binder substansen roseoflavin direkt till FMN-riboswitch-aptameren, vilket undertrycker uttrycket av motsvarande gen i Bacillus subtilis . På liknande sätt hämmar aminoetylcystein tillväxten av vissa grampositiva bakterier genom att binda till lysinriboswitchen. Den antimikrobiella aktiviteten hos ovanstående föreningar reduceras dock till ingenting genom mutationer i motsvarande riboswitch [4] . Det finns riboswitchar som ger antibiotikaresistens . Således är aminoglykosidriboswitchen belägen på mRNA från enzymerna aminoglykosidacetyltransferas och aminoglykosidnukleotidyltransferas, som ger resistens mot aminoglykosidantibiotika. När den är bunden till en aminoglykosid aktiverar riboswitchen transkriptionen av dessa enzymer, vilket ger resistens mot aminoglykosidantibiotika [12] .
| Typer av RNA | |
|---|---|
| Proteinbiosyntes | |
| RNA-bearbetning |
|
| Reglering av genuttryck |
|
| cis-reglerande element | |
| Parasitiska element | |
| Övrig |
|