Forntida DNA- sekvensering (från latin sequentum "sekvens") - bestämning av nukleotidsekvensen i förhållande till DNA- molekyler som extraherats från forntida biologiska prover, såsom paleontologiska och arkeologiska fynd, mumifierade lämningar, torkade växtrester, koproliter . Analys av nukleotidsekvenser som erhållits genom sekvensering av forntida DNA gör det möjligt att fastställa fylogenetiska samband mellan arter och testa hypoteser om förhållandet mellan miljöförändringar och evolutionära förändringar i populationer , och även ge information för att kalibrera molekylära klockor [1] .
När forskare arbetar med forntida DNA står forskare inför många problem relaterade till bevarandet av prover. DNA kan brytas ned med tiden, kemiskt modifierat. Mikroorganismerna som är involverade i sönderdelningen av kvarlevorna bryter inte bara mot vävnadernas integritet , utan introducerar också sitt eget DNA i provet, vilket komplicerar processen att extrahera forntida DNA och bioinformatikanalys av de erhållna uppgifterna. Metoder som nästa generations sekvensering och anrikning av DNA-bibliotek genom hybridisering kan avsevärt öka mängden information som erhålls från prover.
DNA-analysen av ett antal forntida djur utfördes, inklusive mammuten och grottbjörnen . DNA-analys från mänskliga kvarlevor gjorde det möjligt att identifiera en ny grupp gamla människor - Denisovans , samt avslöja detaljer om ursprunget till moderna etniska grupper. Ett antal upptäckter gjordes som ett resultat av analysen av forntida DNA från patogener: en analys gjordes av genomet av pestbacillen från Londons begravningar på 1300-talet och phytophthora- svampen från prover från 1800-talet.
Studier av forntida DNA började 1984 med sekvenseringen av ett fragment av mitokondriellt DNA (mtDNA) från quagga , en underart av Burchells zebra , som dog ut under andra hälften av 1800-talet [2] . DNA har inte bara visat sig vara kvar i mer än ett och ett halvt sekel, utan det kan också delvis isoleras och sekvenseras. Kort därefter sekvenserade Svante Paabo prover från mänskliga mumier. [3] [4] I dessa studier använde forskaren bakteriekloning för att amplifiera DNA-fragment. Det visade sig att det mesta av DNA:t i proverna är av bakteriellt eller svampursprung, och endogent DNA som är mottagligt för amplifiering består huvudsakligen av korta skadade fragment av multikopieloki (till exempel mtDNA) och utgör en liten del av det studerade DNA:t. Uppfinningen av polymeraskedjereaktionen (PCR) gjorde det möjligt att amplifiera även de få kvarvarande DNA-fragmenten och gav impulser till utvecklingen av detta område, men ökade också resultatens känslighet för kontaminering [5] .
Studiet av forntida DNA är viktigt för sådana områden av vetenskap som genetik , paleozoologi , paleoepidemologi , antropologi (särskilt paleoantropologi ) och arkeologi . Detta område har också blivit en del av paleogenetikens metodologi .
Analys av forntida DNA kan användas för att bedöma den evolutionära närheten av taxonomiska grupper av länge utdöda eller kraftigt förändrade organismer, vars specifika släktskap är extremt svåra att ta reda på på andra sätt. Särskild uppmärksamhet ägnas här åt områden med hög variabilitet - regioner av DNA där mutationer förekommer ofta. I synnerhet är dessa korta tandemupprepningar (STR) och singelnukleotidpolymorfismer (SNP). Analys av mitokondriellt DNA ger mer exakt information i samband med denna metod, eftersom mitokondrie-DNA har ett mycket större antal kopior jämfört med kärn-DNA (cirka 1000 kopior av mitokondrie-DNA och 2 kopior av kärn-DNA per cell) [6] .
Analys av forntida DNA gör det också möjligt att bestämma könet på skelettrester av arter vars kvinnliga och manliga individer skiljer sig åt i uppsättningen av könskromosomer, vilket är särskilt viktigt när andra metoder, såsom antropometri , inte kan ge ett korrekt svar [7 ] .
Denna metod finner också sin tillämpning inom ramen för paleoepidemologi. Det är extremt svårt att diagnostisera sjukdomar med hjälp av skelettrester och studera uråldriga pandemier utan att analysera DNA från patogener som bevaras i resterna av patienter. Sådana studier blev möjliga först på 1990-talet, vilket gjorde det möjligt att spåra både utvecklingen av infektiösa bakteriestammar och virus och deras spridning, samt att jämföra symtomen på sjukdomen som upptäckts från kvarlevorna med modern kunskap om en viss sjukdom [ 8] [9] .
Normalt, efter en organisms död, klyvs DNA av endogena nukleaser . Detta händer inte om nukleaserna snabbt förstörs eller inaktiveras, till exempel på grund av uttorkning av resterna, låga temperaturer eller höga saltkoncentrationer. [10] Ändå skadas DNA över tiden av oavsiktlig hydrolys eller oxidation . Hydrolytisk skada inkluderar förstörelse av fosfatryggraden i kedjan, depurinering (motsvarande position förblir utan en kvävebas) och deaminering . Oftare deamineras cytosin till uracil, metylerat cytosin (5-metylcytosin) deamineras till tymin ; mindre vanligt omvandlas adenin till hypoxantin , som är komplementärt till cytosin snarare än tymin, vilket leder till sekvenseringsfelläsningar. Dessa skador uppstår också i levande celler, men där elimineras de under reparationsprocessen . Dessutom förekommer tvärbindningar mellan strängar i DNA-spiralen på grund av alkylering eller tvärbindning av DNA till olika molekyler genom Maillard-reaktionen . Precis som kedjebrott, interfererar tvärbindningar med PCR-amplifiering [5] [10] . Innan sekvensering utsätts forntida DNA för speciell bearbetning för att avlägsna deamineringsprodukter och tvärbindningar. Medellängden på amplifierade fragment av forntida DNA överstiger ofta inte 100 baspar, och för fynd från samma utgrävningsplats minskar medellängden på fragmenten med stigande ålder på fyndet. Nuvarande gamla DNA-sekvenseringsprotokoll tar hänsyn till denna funktion; i synnerhet, istället för att hybridisera primrarna till DNA-fragment, fästs adaptrar till ändarna av fragmenten, och oligonukleotider som är komplementära till adaptrarna fungerar som primers [11] .
Vid låga temperaturer går DNA-nedbrytningen långsammare, vilket säkerställer god bevarande av DNA i prover som finns i permafrostområdet. Man tror dock att även under idealiska förhållanden kan DNA inte bestå i mer än 1 miljon år [5] [10] .
Ofta på grund av kontaminering, eller kontaminering , är endast en liten del av DNA:t i provet av endogent ursprung. De bästa proverna i detta avseende innehåller upp till 90 % av endogent DNA. [ett]
Arkeologiska prover innehåller alltid lite DNA från bakterierna och svamparna som koloniserar lämningarna medan de ligger i marken. Dessutom, i processen att studera forntida DNA, kan mänskligt eller mikrobiellt DNA, som finns i alla laboratorium, komma in i provet. Till skillnad från forntida DNA förstärks modernt DNA väl av PCR. PCR-produkter som innehåller amplifierat modernt DNA kan spridas över hela laboratoriet och därmed öka graden av kontaminering [1] [5] . För att förhindra laboratoriekontamination rekommenderas långvarig behandling av utrustning med ultraviolett eller syra och efterlevnad av kraven i arbetsprotokollet i PCR-laboratorier rekommenderas. Studiet av forntida DNA bör inte utföras i ett laboratorium där moderna prover tidigare har studerats, särskilt närstående arter [5] . Många arkeologiska exemplar, särskilt de som hittades före tillkomsten av moderna molekylärbiologiska metoder, har blivit förorenade under utvinning och undersökning. Om provet hittades för decennier sedan, kan det mänskliga DNA som det är förorenat med ha alla kännetecken för forntida DNA. Ben och tänder har en porös yta vilket gör det svårt att rengöra dem från modernt DNA. Hår visar sig vara att föredra i detta avseende: DNA som finns i det är knappast tillgängligt för bakterier, och den hydrofoba ytan gör det möjligt att rengöra det innan man extraherar DNA:t [1] . I detta fall vittnar sammanträffandet av sekvenserna som erhållits som ett resultat av en oberoende studie av olika delar av provet (till exempel lår och tänder) i olika laboratorier till förmån för sanningen av resultatet [5] .
När det gäller mänskliga kvarlevor kan kontaminering av modernt mänskligt DNA leda till fel i studiet av fylogeni och populationsgenetik . Det finns en statistisk metod som gör det möjligt att skilja gammalt DNA från modernt DNA genom deamineringsmönstret [12] [13] . Om ett DNA-prov är känt för att tillhöra en hona, kan de sekvenserade sekvenserna kartläggas till Y-kromosomen och därmed kan ett manligt DNA-inträde i provet detekteras [14] . Om DNA av icke-mänskligt ursprung undersöks är ett självklart sätt att kontrollera kontaminering att kartlägga sekvenseringsavläsningarna till det mänskliga genomet, såväl som till genomen från andra organismer i fall de skulle kunna vara källor till kontaminering. Vid sekvensering av urgammalt bakteriellt DNA är problemet också att genomen från långt ifrån alla för närvarande existerande bakterier är kända, så från det faktum att den resulterande sekvensen inte ingår i de kända bakteriegenomen kan man inte dra slutsatsen att den tillhör en uråldrig bakterie, och erhölls inte som ett resultat av kontaminering [5] .
Mitokondrie- och plastid -DNA- insättningar finns ofta i nukleärt DNA. När man undersöker forntida DNA-prover kan organell-DNA inte isoleras, så dessa insättningar kan vara en felkälla, eftersom de inte alltid lätt kan särskiljas genom sekvens från verkligt mtDNA eller cpDNA. Om sådana inlägg misstas för organellers DNA kan detta förvränga resultaten av studien av fylogeni eller populationsgenetik [5] .
Som källa till forntida DNA försöker de ofta använda de bevarade kroppsdelarna, som inte är av stort intresse ur den anatomiska strukturens synvinkel. På grund av de processer som beskrivs ovan, i de flesta forntida prover, är innehållet av forntida DNA av intresse för forskare mycket litet - bara cirka 1%. Denna mängd varierar mycket beroende på provets natur. Nyligen genomförda studier visar att ett mycket större utbyte av endogent DNA från resterna av mänskliga förfäder uppnås genom att isolera material från tänderna och petrusdelen av tinningbenet . [femton]
Det första steget är att mala provet och isolera DNA:t. När det gäller benrester används sandblästringspistoler eller specialiserade övningar för primär fragmentering. Vidare krossas partiklarna ytterligare (till pulvertillstånd) i omrörningskvarnar. Pulvret behandlas sekventiellt med en uppsättning reagenser och utsätts för centrifugering för att rena DNA från mineraler och andra föroreningar [16] .
Nästa steg är produktionen av DNA-bibliotek och deras anrikning genom hybridisering [17] . Direkt erhållande av nukleotidsekvensen utförs genom nästa generations sekvensering .
2012 presenterade en artikel i tidskriften Methods of Molecular Biology möjliga metoder för att isolera gammalt DNA från bevarade växtexemplar. Precis som i fallet med forntida djur-DNA, överlever paleoplantaprover intakta till vår tid, ofta på grund av avkylning under storskaliga nedisningar [18] .
"Antediluvian" (eng. antediluvian ) kallades DNA äldre än 1 miljon år. Namnet föreslogs 1993 av Tomas Lindahl i en recension i Nature [19] . På 1990-talet dök det upp rapporter om sekvensering av DNA som bevarats i miljontals år i växtfossiler, dinosaurieben och inneslutningar i bärnsten. Vissa av dessa resultat beror med stor sannolikhet på kontaminering, medan andra inte var reproducerbara. [5] [10] Till exempel, som svar på en publikation i Science om sekvensering av ett fragment av mitokondriellt DNA från ett dinosaurieben från kritaperioden (80 miljoner år sedan), publicerades anteckningar, varav en indikerade att när man byggde en fylogenetiskt träd, en sekvens från en dinosaurieben kluster med en människa snarare än en ortolog mtDNA-region av fåglar eller krokodil, vilket indikerar en hög sannolikhet för kontaminering [20] ; en annan notering föreslog [21] att sekvensen som tillskrivs dinosaurien faktiskt är en gammal mtDNA-insättning i den mänskliga kromosomen som finns i provet [22] .
Välbevarade prover tillåter partiell, och i vissa fall till och med fullständig, sekvensering av kärngenomet . 2008 sekvenserades DNA från ullen från två mammutar som dog för cirka 20 000 och 59 000 år sedan. Kartläggning till utkastet till sammansättning av det afrikanska elefantgenomet gjorde det möjligt att uppskatta andelen endogent DNA i dessa prover till 90 % respektive 58 %; det mesta av kontamineringen i båda fallen var bakteriellt DNA och sekvenser, vars ursprung inte kunde fastställas. De erhållna uppgifterna gjorde det möjligt att uppskatta tidpunkten för divergensen mellan mammuten och den afrikanska elefanten till 7,5 miljoner år, och tidpunkten för divergensen mellan mammutens två linjer, för vilka proverna togs, till 1,5-2 miljoner år . Samtidigt matchar mammuternas sekvenserade DNA det hos elefanter med 99,41 % på nukleotidnivå och 99,78 % på aminosyranivå (det vill säga skillnaden är ungefär 1 rest per protein). Tillhörigheten av M4 och M25 till olika klader har tidigare fastställts baserat på mitokondriell DNA- sekvensering , och den nya skattningen för divergenstiden överensstämmer med och förfinar mtDNA-uppskattningen. Ett av målen med mammutsekvensering var att identifiera funktionellt viktiga aminosyraskillnader mellan mammut och elefant. Nittiotvå skillnader mellan dessa arter valdes ut som kan vara av funktionell betydelse, och av vilka några kan ha varit under positivt urval [23] .
I en av de tidigare studierna togs resterna av åtta mammutar från Mammoth Museum i Khatanga, välbevarade vid låga temperaturer, som prov. För det bästa urvalet, 45,4% av DNA-fragmenten anpassade till elefantgenomet, med en likhet mellan elefant- och mammut-DNA på 98,55% utan justering för ökade skillnader på grund av deaminering [24] .
År 2013 erhölls en utkastversion av det antika hästgenomet [25] . Åldern på provet uppskattas till 560-780 tusen år. I slutet av 2013 är detta det äldsta kompletta kärngenomet. DNA från en häst från sen Pleistocen (~43 tusen år sedan), fem moderna hästraser, en Przewalski-häst och en åsna sekvenserades också. Fylogenetisk analys visade att den sista gemensamma förfadern till hela släktet Horse levde för 4-4,5 miljoner år sedan, vilket visade sig vara dubbelt så mycket som tidigare accepterat uppskattning; populationerna av förfäderna till Przewalskis häst och tamhästen skiljde sig för 38-72 tusen år sedan. Samma år återställdes den mitokondriella DNA-sekvensen för en grottbjörn från den spanska bengrottan , som levde i Mellersta Pleistocen för 179–680 tusen år sedan, och tekniken för att förbereda gammalt DNA för sekvensering optimerades för bättre läsning av korta (30–50 bp) fragment [11] . Från och med oktober 2013 har det antika genomet sekvenserats med mer än en täckning endast för ryggradsdjur som människor, isbjörnar och hästar.
Det första steget i att studera neandertalarnas genetiska material var att arbeta med mitokondrie-DNA isolerat från ben som upptäcktes 1856 i Neanderthaldalen (Tyskland). 2006 startades ett projekt för att sekvensera hela neandertalgenomet . I arbetet användes DNA från lämningar från Vindiagrottan i Kroatien, samt från några andra ben. Justering av det erhållna genomet tillsammans med det moderna mänskliga genomet och schimpansgenomet gjorde det möjligt att grovt uppskatta tiden för divergensen mellan moderna människor och neandertalare till 270-440 tusen år, förutsatt att människor och schimpanser skiljde sig åt för 6,5 miljoner år sedan [26] . Genomerna från neandertalarna från Sidrone Cave (Spanien), Feldhofer Cave (Tyskland), Mezmayskaya Cave (Ryssland) skiljer sig något från den första.
DNA-sekvensering av forntida människor ger hopp om att identifiera funktionella genomiska mutationer som skiljer forntida människor från apor, samt att spåra skillnaderna mellan moderna människor och forntida människor. Studien avslöjade ett förvånansvärt litet antal fixerade substitutioner i genomet under en ganska lång tid. Endast 5 gener hittades där mer än en substitution registrerades hos moderna människor, vilket förändrade proteinets struktur (jämfört med Neanderthal, som sammanföll med schimpanser på dessa platser): RPTN , SPAG17, CAN15, TTF1 och PCD16.
Jämförelse av SNP- diversitet för neandertalare och moderna människor gör det möjligt att lokalisera målen för positivt urval i genomet. Den största sådana regionen av genomet som identifierats genom analys av SNP-skillnader tillhör THADA-genen SNPs dess omedelbara miljö är associerade med typ 2-diabetes, och uttrycket av denna gen skiljer sig signifikant mellan diabetiker och friska personer. I samma region hittades en insättning av 9 nukleotider i det mänskliga genomet, vilket saknas i alla kända genom från möss till primater och neandertalare. Dessutom är SNP i andra regioner associerade med schizofreni , Downs syndrom och autism . Av intresse är RUNX2-genen som enda kända genen som för närvarande är associerad med utvecklingen av klavikulär-kraniell dysostos . SNP-analysen avslöjar också blandningen av genetiskt material från neandertalarna i DNA från icke-afrikaner, vilket bekräftar teorin om att neandertalare korsades med moderna människor, vilket inträffade efter att befolkningen i de senare släpptes från Afrika.
Det var analysen av forntida DNA som gjorde det möjligt att upptäcka denna typ av forntida människor - man trodde till en början att skelettfragmenten som hittades i Denisova-grottan (två falanger av fingrar och tre molarer) tillhörde neandertalare. Mitokondriell DNA- sekvensering av kvarlevorna motbevisade teorin och visade att de tillhör en separat grupp. Skillnaden mellan denisovaner och moderna människor är 2 gånger större än skillnaden mellan neandertalare och moderna människor, men för nukleärt DNA är dessa skillnader av samma ordning. En möjlig förklaring är att denisovaner och neandertalare härstammar från en gemensam förfader som tidigare hade splittrats från en gren av framtida moderna människor. Denna hypotes bekräftades genom en jämförelse av två genom från forntida människor (Denisovets, Neandertalare) och fem genom från moderna människor (representanter för Frankrike, Kina, Papua Nya Guinea , afrikanska folk från Yoruba och Bushmen ), samt anpassning av genomer från denisovaner, neandertalare och afrikaner från Yoruba på schimpansgenomet . Dessutom visade studien att denisovaner och neandertalare är systergrupper. Det har också visat sig att denisovaner, liksom neandertalare, korsade sig med vissa icke-afrikanska populationer av moderna människor: en blandning av neandertal-DNA finns i alla icke-afrikanska grupper, och en blandning av denisovaner finns i papuaner och melanesier [14] .
Filogenetiska slutsatser baserade på nukleära och mitokondriella DNA-data skiljer sig åt. Detta kan förklaras av det faktum att Denisovan mtDNA kommer från någon forntida härstamning som inte slog rot i neandertalare och moderna människor. Den stora storleken på de gamla populationerna gör denna hypotes rimlig, även om det fortfarande inte finns tillräckligt med data för att entydigt lösa detta problem.
En analys av Heidelbergmannens nästan fullständiga mitokondriella genom från Bengrottan gjorde det möjligt att uppskatta fyndets ålder till 150-640 tusen år och visade att de mitokondriella genomen är mer lika för Heidelbergmannen och Denisovans än för dessa arter och neandertalarna, även om människorna från Cave of Bones liknar neandertalarna i morfologiska drag. Det finns flera möjliga förklaringar. The Cave of Bones-människor kan representera en grupp som skiljer sig från både neandertalare och denisovaner som bidrog till Denisovan mtDNA, men denna version förklarar inte de morfologiska egenskaperna hos neandertalare i en art som inte är direkt relaterad till dem. Den andra möjliga förklaringen är att Heidelbergfolket är släkt med de gemensamma förfäderna till neandertalare och denisovaner, men denna version antyder att det finns två mycket divergerande mtDNA-linjer i denna grupp, förfäder till neandertalare och denisovaner. För det tredje kan påverkan från föga studerade mänskliga underarter, som skulle kunna bidra till mtDNA hos Heidelbergfolket och Denisovans, inte uteslutas. Nukleär DNA-analys kan förtydliga bilden [27] .
Information om cytosinmetylering i CpG kan hämtas direkt från sekvenseringsdata 28Deaminering , som sker slumpmässigt över tiden, omvandlar ometylerat cytosin till uracil och metylerat cytosin till tymin . Det gamla DNA-sekvenseringsprotokollet involverar behandling av DNA med uracil-DNA-glykosylas och endonukleas VIII, som ett resultat av vilket uracil avlägsnas och DNA- molekylen knäcks på lämplig plats med avlägsnande av den skadade nukleotiden [29] . Som ett resultat, vid sekvensering för de positioner där cytosin metylerats, kommer en stor procentandel av avläsningar med T att erhållas, och ometylerat cytosin kommer att läsas som C för de molekyler där deaminering på detta ställe inte inträffade.
Baserat på DNA-sekvensen extraherad från håret på de 4000 år gamla resterna av paleo-eskimå , var det möjligt att konstruera en genomomfattande karta över nukleosomer och metylering [30] och metyleringsprofilen visade sig att vara nära det som observeras i moderna människors hår.
En metyleringskarta har också rekonstruerats för neandertalare och denisovaner [28] [31] . Deras metylom visade sig likna den hos moderna människor, särskilt i genregionen "hushållning" , men omkring 2000 regioner hittades med betydande skillnader i metylering . I synnerhet hos forntida människor hittades markerade områden i HOXD- klustret som var involverade i regleringen av extremiteternas utveckling, vilket kan förklara sådana anatomiska skillnader mellan dem och moderna människor, såsom kortare lemmar, stora händer , breda armbågs- och knäleder [28 ] [31] .
Moderna metoder för extraktion och sekvensering av forntida DNA tillåter oss att studera patogener som erhållits från resterna av människor som länge har dött av sjukdomen. Fylogenetisk analys av de erhållna proverna gör det möjligt att återställa utvecklingen av patogena organismer. Medeltida stammar av pestbacillen och Hansens bacill , samt en stam av Kochs bacill från 1800 -talet, har sekvenserats.
Studier av det gamla DNA från pestbacillen ( Yersinia pestis ), som erhållits från begravningarna i London av offer för digerdöden, fastställde att dåtidens pestbacill, förutom möjliga genomiska omarrangemang som är karakteristiska för denna art, och begränsade till enstaka nukleotider polymorfismer , skilde sig lite från moderna stammar. Dessutom, för alla polymorfismer som skiljer den från den moderna stammen, innehöll den en variant av förfadern till pestbacillen - Y. pseudotuberculosis . Dessa data tyder på att genotypen av den forntida pestbacillen inte var huvudorsaken till dess höga virulens vid den tiden och att dess bidrag kanske var i nivå med bidraget från sådana faktorer som den genetiskt bestämda känsligheten hos bärare, klimat, socialt tillstånd och interaktioner med andra sjukdomar. Med hjälp av fylogenetisk analys fastställdes det tidsintervall under vilket den sista gemensamma förfadern till alla moderna mänskliga patogena stammar av pestbacillen levde: 1282–1343, och den antika bakterien låg närmast det fylogenetiska trädets förfäders nod [32 ] .
År 2013 publicerades en landmärke sekvenseringsstudie av gamla patogener på de nu nedlagda Phytophthora infestans-stammarna som orsakade den irländska potatissvälten i mitten av 1800-talet . Det genetiska materialet för dessa patogener isolerades från konserverade potatis- och tomatblad från olika tider. Tills nu, på grund av bristen på sekvenseringsmetoder, var dataanalys inte möjlig. Forskare analyserade olika stammar av patogener och isolerade relaterade stammar från växter i Irland, Nordamerika och Europa . Studier har visat att gruppen av stammar som orsakade den ovannämnda svälten (HERB-1) och den nordamerikanska gruppen (US-1) hade den sista gemensamma förfadern, förmodligen i Mexiko vid 1700- och 1800-talens skiftning .
Denna studie är särskilt intressant ur synvinkeln av tillvägagångssätt för analys av det gamla DNA från patogener från tidigare epidemier, både djur och växter . Detta område är i ett tidigt skede av sin utveckling, men om biologiska banker systematiskt etableras kan sådan kunskap avsevärt bidra till det accelererade sökandet efter antimikrobiella medel inom en snar framtid, i händelse av epidemier orsakade av relaterade patogener [33] .