Sluten nukleinsyra

En låst nukleinsyra ( LNA), även känd som en överbryggande  nukleinsyra (BNA) [1] och ofta hänvisad till som otillgänglig RNA , är en modifierad RNA- nukleotid i vilken ett ribosfragment modifieras med en extra brygga som förbinder 2'- syregrupp. och 4' kol. Bron "låser" ribosen i 3'- endo (norra) konformationen, som ofta finns i A-form duplex . Denna struktur ger ökat motstånd mot enzymatisk nedbrytning [2] [3] [4] [5] . LNA erbjuder också ökad specificitet och affinitet för basparning som en monomer eller komponent i en oligonukleotid [6] . LNA-nukleotider kan blandas med DNA- eller RNA-rester i en oligonukleotid.

Syntes

Obika et al var de första att kemiskt syntetisera LNA 1997 [7] och Jesper Wengels grupp följde självständigt efter 1998 [8] . Detta blev möjligt efter att Zamechnik och Stevenson 1978 lade grunden för möjligheten att oligonukleotider kan vara utmärkta medel för att kontrollera genuttryck [9] . Hittills har två olika tillvägagångssätt, kallade linjära respektive konvergenta strategier, visat sig ge hög prestanda och effektivitet i LNA. Den linjära syntesstrategin beskrevs först i detalj av Obick et al. [7] I detta tillvägagångssätt kan uridin (eller någon tillgänglig RNA- nukleosid ) användas som utgångsmaterial . Den konvergerande strategin kräver syntes av ett mellanliggande socker som fungerar som en glykosyldonator , nödvändig för att binda till kvävehaltiga baser . Vanligtvis används D-glukos för att framställa ett mellanliggande socker, som därefter reageras med kvävehaltiga baser med hjälp av en modifierad Vorbrügen-procedur som tillåter stereoselektiv bindning [10] .

Tillägget av olika fragment förblir möjligt samtidigt som de bibehåller viktiga fysikalisk-kemiska egenskaper såsom hög affinitet och specificitet uppenbar i det ursprungligen syntetiserade LNA [11] . Sådana oligomerer syntetiseras kemiskt och är kommersiellt tillgängliga.

Inkludering i DNA/RNA

LNA kan inkorporeras i DNA och RNA genom promiskuiteten hos vissa DNA- och RNA-polymeraser. Phusion DNA-polymeras, ett kommersiellt utvecklat enzym baserat på Pfu DNA-polymeras , införlivar effektivt LNA i DNA [12] .

Egenskaper

LNA ger ökad biostabilitet jämfört med biologiska nukleinsyror . LNA-modifierade oligonukleotider har visat förbättrad termodynamik när de hybridiserats till RNA , enkelsträngat DNA och dubbelsträngat DNA [13] .

Applikation

LNA vintrar

DNAzymer kan modifieras för att inkludera LNA-rester för att bilda LNAzymer (LNA-modifierade DNAzymer). Dessa modifierade oligonukleotider, liksom deras relaterade DNAzymer, är vanligtvis endonukleaser som binder till specifika mål-RNA-sekvenser och klyver fosfodiesterbindningen som finns mellan nukleotider [14] . Men de uppvisar mer effektiv fosfodiesterbindningsklyvning jämfört med deras omodifierade motsvarigheter [15] . Modifiering av DNAzyme- substratigenkänningsarmar med LNA- monomerer producerar ett LNAzyme som känner igen Coxsackievirus A21 (CAV-21) och klyver dess mål- RNA- sekvens , liknande den i den 5' otranslaterade regionen (5'UTR) av humant rhinovirus -14 (HRV- 14); en sekvens som inte känns igen av omodifierade DNAzymer [16] .

Terapi

Den terapeutiska användningen av LNA-baserade oligonukleotider är ett nytt område inom bioteknik [17] . Olika LNA-oligonukleotider utvärderades för deras farmakokinetiska och toxicitetsprofiler. Studier har dragit slutsatsen att LNA-toxicitet i allmänhet är oberoende av oligonukleotidsekvensen och uppvisar en föredragen säkerhetsprofil för translaterbara terapeutiska tillämpningar [11] .

LNA har undersökts för sina terapeutiska egenskaper vid behandling av cancer och infektionssjukdomar. En blockerad antisens-nukleinsyrafosforotioatmolekyl, benämnd SPC2996, designades för att rikta in sig på mRNA som kodar för Bcl-2-onkoproteinet, ett protein som hämmar apoptos i celler av kronisk lymfatisk leukemi (CLL). Fas I och II kliniska prövningar visade en dosberoende minskning av cirkulerande CLL-celler i cirka 30 % av provet, vilket tyder på ytterligare studie av SPC2996 [18] .

LNA har också applicerats på Miravirsen , ett experimentellt läkemedel mot hepatit C , som är en 15-nukleotid fosfortioatsekvens med bindningsspecificitet för MiR-122 ( miRNA uttryckt i hepatocyter ) [19] [20] .

Detektion och diagnos

Allelspecifik PCR med användning av LNA tillåter design av kortare primers utan att offra bindningsspecificitet [21] .

LNA har inkluderats i fluorescerande in situ hybridisering (FISH) [22] . FISH är en vanlig teknik som används för att visualisera genetiskt material i en mängd olika celler, men studier har visat att denna teknik har begränsats av probernas dåliga hybridiseringseffektivitet. Omvänt har LNA-inkorporerade prober visat ökad hybridiseringseffektivitet i både DNA och RNA . Förbättrad FISH-prestanda med LNA-inkludering har lett till FISH-analys av mänskliga kromosomer, flera icke-mänskliga celltyper och mikroarrayer [22] .

LNA-genotypningsanalyser har också utförts, specifikt för att detektera mutationer i apolipoprotein B [23] .

På grund av sin höga förmåga att skilja mellan inkonsekvenser har LNA studerats för dess tillämpning i diagnostiska verktyg. Immobiliserade LNA-sonder har införts i multiplex SNP-genotypningsanalyser [24] .

Genredigering

LNA-modifierade ssODNs (syntetiska enkelsträngade DNA-oligonukleotider) kan användas, liksom vanliga ssODNs, för att redigera enkelbasgener. Användningen av LNA vid eller nära den avsedda platsen för modifiering undviker DNA- felparningsreparation på grund av den högre termodynamiska stabiliteten den har [25] .

Referenser

1. ↑ Elayadi, Anissa N. (augusti 2002). "Implikationer av högaffinitetshybridisering av låsta nukleinsyraoligomerer för hämning av humant telomeras †" . Biokemi _ _ ]. 41 (31): 9973-9981. DOI : 10.1021/bi025907j . ISSN  0006-2960 . PMID  12146961 .
2. ↑ Kurreck, J. (2002-05-01). "Design av antisens-oligonukleotider stabiliserade av låsta nukleinsyror". Nukleinsyraforskning . 30 (9): 1911-1918. DOI : 10.1093/nar/30.9.1911 . PMID  11972327 .
3. ↑ Frieden, M. (2003-11-01). "Utöka designhorisonten för antisensoligonukleotider med alfa-L-LNA". Nukleinsyraforskning _ _ ]. 31 (21): 6365-6372. DOI : 10.1093/nar/gkg820 . ISSN  1362-4962 . PMID  14576324 .
4. ↑ Frieden, Miriam (oktober 2003). "Nukleasstabilitet för LNA-oligonukleotider och LNA-DNA-chimärer" . Nukleosider, nukleotider och nukleinsyror ]. 22 (5-8): 1041-1043. DOI : 10.1081/NCN-120022731 . ISSN  1525-7770 . PMID  14565339 .
5. ↑ Morita, K. (2001-11-01). "2'-O, 4'-C-Etylen-bryggade nukleinsyror (ENA) med nukleasresistens och hög affnitet för RNA". Nucleic Acids Symposium Series ]. 1 (1): 241-242. DOI : 10.1093/nass/1.1.241 . ISSN 0261-3166 . PMID 12836354 .  
6. ↑ Medicinsk kemi av nukleinsyror . - Hoboken, NJ: John Wiley & Sons, 2011. - 1 onlineresurs sid. - ISBN 978-1-118-09280-4 , 1-118-09280-5 , 978-1-118-09283-5 , 1-118-09283-X 283-23990-5, 1-1818-392 , 978-1-118-09281-1.
7. ↑ 1 2 Obika, Satoshi (1997-12-15). "Syntes av 2'-O,4'-C-metyleneuridin och -cytidin. Nya bicykliska nukleosider med en fixerad C3, -endosockerrynkning” . Tetrahedronbokstäver [ engelska ] ]. 38 (50): 8735-8738. DOI : 10.1016/S0040-4039(97)10322-7 . ISSN  0040-4039 .
8. ↑ Orum, Miriam Frieden och Henrik (2008-03-31). "Låst nukleinsyra har ett löfte vid behandling av cancer" . Nuvarande läkemedelsdesign _ ]. 14 (11): 1138-1142. DOI : 10.2174/138161208784246234 . PMID 18473860 . Hämtad 2020-10-06 . 
9. ↑ Zamecnik, PC (1978-01-01). "Hämning av Rous sarkomvirusreplikation och celltransformation av en specifik oligodeoxinukleotid". Proceedings of the National Academy of Sciences ]. 75 (1): 280-284. Bibcode : 1978PNAS...75..280Z . DOI : 10.1073/pnas.75.1.280 . ISSN 0027-8424 . PMID 75545 .  
10. ↑ Koshkin, Alexei A. (2001-12-01). "En förenklad och effektiv väg till 2'-O, 4'-C-metylenkopplade bicykliska ribonukleosider (låst nukleinsyra)" . The Journal of Organic Chemistry . 66 (25): 8504-8512. doi : 10.1021/ jo010732p . ISSN 0022-3263 . PMID 11735531 .  
11. ↑ 1 2 Orum, Miriam Frieden och Henrik (2008-03-31). "Låst nukleinsyra har ett löfte vid behandling av cancer" . Nuvarande läkemedelsdesign _ ]. 14 (11): 1138-1142. DOI : 10.2174/138161208784246234 . PMID 18473860 . Hämtad 2020-10-06 . Orum, Miriam Frieden och Henrik (2008-03-31). "Låst nukleinsyra håller löfte vid behandling av cancer" . Nuvarande läkemedelsdesign . 14 (11): 1138-1142. doi : 10.2174/138161208784246234 . PMID  18473860 . Hämtad 2020-10-06 .
12. ↑ Veedu, Rakesh N. (2007-03-26). "Enzymatisk inkorporering av LNA-nukleotider i DNA-strängar" . ChemBioChem [ engelska ] ]. 8 (5): 490-492. doi : 10.1002/ cbic.200600501 . PMID 17315250 . 
13. ↑ Veedu, Rakesh N. (2007-03-26). "Enzymatisk inkorporering av LNA-nukleotider i DNA-strängar" . ChemBioChem [ engelska ] ]. 8 (5): 490-492. doi : 10.1002/ cbic.200600501 . PMID 17315250 . Veedu, Rakesh N.; Vester, Birte; Wengel, Jesper (2007-03-26). "Enzymatisk inkorporering av LNA-nukleotider i DNA-strängar" . ChemBioChem . 8 (5): 490-492. doi : 10.1002/cbic.200600501 . PMID  17315250 . S2CID  10206060 .
14. ↑ Breaker, R. R. (december 1994). "Ett DNA-enzym som klyver RNA" . Kemi & biologi . 1 (4): 223-229. DOI : 10.1016/1074-5521(94)90014-0 . ISSN  1074-5521 . PMID  9383394 .
15. ↑ Vester, Birte (november 2002). "LNAzymes: Inkorporering av monomerer av LNA-typ i DNAzymer ökar markant RNA-klyvningen" . Journal of the American Chemical Society ]. 124 (46): 13682-13683. DOI : 10.1021/ja0276220 . ISSN 0002-7863 . PMID 12431091 .  
16. ↑ Schubert, Steffen (maj 2004). "Få målåtkomst för deoxiribozymer." Journal of Molecular Biology ]. 339 (2): 355-363. DOI : 10.1016/j.jmb.2004.03.064 . PMID 15136038 . 
17. ↑ "LNA: ett mångsidigt verktyg för terapi och genomik". Trender inom bioteknik . 21 (2): 74-81. Februari 2003. DOI : 10.1016/S0167-7799(02)00038-0 . PMID  12573856 .
18. ↑ Dürig, J. (april 2011). "Den nya antisens Bcl-2-hämmaren SPC2996 orsakar snabb clearance av leukemiceller och immunaktivering vid kronisk lymfatisk leukemi." Leukemi [ engelska ] ]. 25 (4): 638-647. DOI : 10.1038/leu.2010.322 . ISSN  1476-5551 . PMID21358717  . _
19. ↑ Gebert, Luca F.R. (2014-01-01). "Miravirsen (SPC3649) kan hämma biogenes av miR-122." Nukleinsyraforskning . 42 (1): 609-621. doi : 10.1093/nar/ gkt852 . ISSN 0305-1048 . PMID24068553 . _  
20. ↑ Bonneau, E. (2019-06-24). "Hur nära är miRNA från klinisk praxis? Ett perspektiv på den diagnostiska och terapeutiska marknaden”. EJIFCC . 30 (2): 114-127. ISSN  1650-3414 . PMID  31263388 .
21. ↑ Bonetta L (2005). "Bästa tid för PCR i realtid". Nat. Metoder . 2 (4): 305-312. DOI : 10.1038/nmeth0405-305 .
22. ↑ 1 2 Kubota, Kengo (augusti 2006). "Förbättrad in situ hybridiseringseffektivitet med låsta nukleinsyra-inkorporerade DNA-sonder". Tillämpad och miljömikrobiologi . 72 (8): 5311-5317. DOI : 10.1128/AEM.03039-05 . ISSN  0099-2240 . PMID  16885281 .
23. ↑ Kubota, Kengo (augusti 2006). "Förbättrad in situ hybridiseringseffektivitet med låsta nukleinsyra-inkorporerade DNA-sonder". Tillämpad och miljömikrobiologi . 72 (8): 5311-5317. DOI : 10.1128/AEM.03039-05 . ISSN  0099-2240 . PMID  16885281 .Kubota, Kengo; Ohashi, Akiyoshi; Imachi, Hiroyuki; Harada, Hideki (augusti 2006). "Förbättrad in situ hybridiseringseffektivitet med låsta nukleinsyra-inkorporerade DNA-sonder" . Tillämpad och miljömikrobiologi . 72 (8): 5311-5317. doi : 10.1128/AEM.03039-05 . ISSN  0099-2240 . PMC  1538721 . PMID  16885281 .
24. ↑ "LNA: ett mångsidigt verktyg för terapi och genomik". Trender inom bioteknik . 21 (2): 74-81. Februari 2003. DOI : 10.1016/S0167-7799(02)00038-0 . PMID  12573856 .Petersen M, Wengel J (februari 2003). "LNA: ett mångsidigt verktyg för terapi och genomik". Trender inom bioteknik . 21 (2):74-81. doi : 10.1016/S0167-7799(02)00038-0 . PMID  12573856 .
25. ↑ van Ravesteyn, TW (12 april 2016). "LNA-modifiering av enkelsträngade DNA-oligonukleotider tillåter subtil genmodifiering i missmatchningsreparationskunniga celler." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America . 113 (15): 4122-7. DOI : 10.1073/pnas.1513315113 . PMID  26951689 .