Polymeraskedjereaktion

Polymeraskedjereaktion ( PCR ) är en metod för molekylärbiologi som gör det möjligt att uppnå en signifikant ökning av små koncentrationer av vissa nukleinsyrafragment ( DNA eller RNA ) i biologiskt material (prov).

Förutom DNA- amplifiering tillåter PCR många andra manipulationer med nukleinsyror (införande av mutationer , splitsning av DNA-fragment) och används i stor utsträckning inom biologisk och medicinsk praxis, till exempel för att diagnostisera sjukdomar (ärftliga, smittsamma), för att fastställa faderskap , att klona gener , att isolera nya gener .

Historik

I början av 1970-talet föreslog den norske vetenskapsmannen Kjell Kleppe från nobelpristagarens laboratorium Hara Gobinda Korana en metod för DNA- amplifiering med användning av ett par korta enkelsträngade DNA-molekyler - syntetiska primers [1] . Men på den tiden förblev denna idé orealiserad. Polymeraskedjereaktionen (PCR) uppfanns 1983 av den amerikanske biokemisten Kary Mullis [2] [3] . Hans mål var att skapa en metod som skulle möjliggöra amplifiering av DNA under flera på varandra följande duplikationer av den ursprungliga DNA-molekylen med hjälp av DNA-polymerasenzymet . Den första publikationen om PCR-metoden publicerades i november 1985 i tidskriften Science [4] . Metoden har revolutionerat molekylärbiologi och medicin. 1993 fick Kary Mullis Nobelpriset i kemi för detta [5] .

I början av användningen av metoden, efter varje uppvärmnings-kylningscykel, måste DNA-polymeras tillsättas till reaktionsblandningen , eftersom den inaktiverades vid den höga temperatur som var nödvändig för att separera strängarna i DNA-spiralen. Reaktionsförfarandet var relativt ineffektivt och krävde mycket tid och enzym. 1986 förbättrades polymeraskedjereaktionsmetoden avsevärt. Det har föreslagits att använda DNA-polymeraser från termofila bakterier [6] . Dessa enzymer visade sig vara termostabila och kunde motstå många reaktionscykler. Deras användning gjorde det möjligt att förenkla och automatisera PCR. En av de första termostabila DNA-polymeraserna isolerades från Thermus aquaticus- bakterier och fick namnet Taq- polymeras . Nackdelen med detta polymeras är den ganska höga sannolikheten för att introducera en felaktig nukleotid, eftersom detta enzym saknar felkorrigeringsmekanismer (3'→5' - exonukleasaktivitet ). Polymeraserna Pfu och Pwo , isolerade från archaea , har en sådan mekanism; deras användning minskar avsevärt antalet mutationer i DNA, men hastigheten på deras arbete (processivitet) är lägre än för Taq . Blandningar av Taq och Pfu används nu för att uppnå både hög polymerisationshastighet och hög kopieringsnoggrannhet.

Vid tiden för uppfinningen av metoden arbetade Kary Mullis som syntetisk kemist (han syntetiserade oligonukleotider, som sedan användes för att detektera punktmutationer genom hybridisering med genomiskt DNA) på Cetus Corporation , som patenterade PCR-metoden. 1992 sålde Cetus rättigheterna till metoden och patentet för användningen av Taq - polymeras till Hofmann-La Roche för 300 miljoner dollar. Det visade sig dock att Taq- polymeras karakteriserades av de sovjetiska biokemisterna A. Kaledin , A. Slyusarenko och S. Gorodetsky 1980 [7] , och även 4 år före denna sovjetiska publikation, det vill säga 1976, av de amerikanska biokemisterna Alice Chien, David B. Edgar och John M. Trela ​​[8] . Som ett resultat försökte Promega tvinga Roche att avstå från sina exklusiva rättigheter till detta enzym [9] i domstol . Det amerikanska patentet för PCR-metoden gick ut i mars 2005.

Genomför PCR

Metoden är baserad på multipel selektiv kopiering av en viss del av DNA -nukleinsyran med hjälp av enzymer under artificiella förhållanden ( in vitro ). I detta fall kopieras endast det område som uppfyller de angivna villkoren, och endast om det finns i provet som studeras. Till skillnad från DNA-amplifiering i levande organismer ( replikation ) amplifieras relativt korta DNA- sträckor med PCR . I en konventionell PCR-process är längden på replikerade DNA-regioner inte mer än 3000 baspar (3 kbp [10] ). Med hjälp av en blandning av olika polymeraser, med användning av tillsatser, och under vissa förhållanden, kan längden på ett PCR-fragment nå 20-40 tusen baspar. Detta är fortfarande mycket mindre än längden på kromosomalt DNA i en eukaryot cell. Till exempel är längden på den kortaste nukleära kromosomen hos människor (kromosom 21) 46,71 miljoner baspar [11] .

Reaktionskomponenter

För PCR krävs i det enklaste fallet följande komponenter:

• DNA-mall som innehåller den del av DNA som ska amplifieras .
• Två primrar som är komplementära till motsatta ändar av olika strängar av det önskade DNA-fragmentet.
• Termostabilt DNA-polymeras  är ett enzym som katalyserar polymerisationen av DNA. Polymeras för användning i PCR måste förbli aktivt vid hög temperatur under lång tid, därför används enzymer isolerade från termofiler - Thermus aquaticus ( Taq polymerase ), Pyrococcus furiosus ( Pfu polymerase), Pyrococcus woesei ( Pwo polymerase ), Thermus thermophilus ( Tth -polymeras) och andra.
• Deoxiribo nukleosidtrifosfater (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
• Mg 2+ joner nödvändiga för att polymeras ska fungera.
• Buffertlösning som ger nödvändiga reaktionsförhållanden - pH , lösningens jonstyrka . Innehåller salter, bovint serumalbumin .

För att undvika avdunstning av reaktionsblandningen tillsätts en högkokande olja, såsom vaselin, i provröret. Om en uppvärmd lockcykler används krävs detta inte.

Tillsatsen av pyrofosfatas kan öka PCR-utbytet. Detta enzym katalyserar hydrolysen av pyrofosfat , en biprodukt av tillsatsen av nukleosidtrifosfater till den växande DNA-strängen, till ortofosfat . Pyrofosfat kan hämma PCR [12] .

Primers

Specificiteten för PCR är baserad på bildningen av komplementära komplex mellan mall och primrar , korta syntetiska oligonukleotider 18-30 baser långa. Var och en av primrarna är komplementära till en av kedjorna i den dubbelsträngade mallen och begränsar början och slutet av den amplifierade regionen.

Efter hybridisering av mallen med primern (annealing [13] ) fungerar den senare som en primer för DNA-polymeras under syntesen av den komplementära strängen av mallen (se nedan ).

Den viktigaste egenskapen hos primrar är smälttemperaturen (Tm ) för primer-matriskomplexet.

Tm är  den temperatur vid vilken hälften av DNA-mallarna bildar ett komplex med oligonukleotidprimern. Den genomsnittliga formeln för att beräkna Tm för en kort oligonukleotid (och för långa DNA-fragment), med hänsyn till koncentrationen av K + -joner och DMSO :

där  är antalet nukleotider i primern,  är den molära koncentrationen av kaliumjoner,  är summan av alla guaniner och cytosiner .

Om längden och nukleotidsammansättningen av primern eller hybridiseringstemperaturen väljs felaktigt, är bildningen av delvis komplementära komplex med andra regioner av mall-DNA möjlig, vilket kan leda till uppkomsten av ospecifika produkter. Den övre gränsen för smälttemperaturen begränsas av den optimala verkningstemperaturen för polymeraset, vars aktivitet sjunker vid temperaturer över 80 °C.

När du väljer primers är det önskvärt att följa följande kriterier:

• GC sammansättning ~ 40–60%;
• nära Tm - primrar (skillnader inte mer än 5 °C);
• frånvaron av ospecifika sekundära strukturer - hårnålar [15] och dimerer [16] ;
• guanin eller cytosin är önskvärt i 3'-änden , eftersom de bildar tre vätebindningar med mallmolekylen, vilket gör hybridiseringen mer stabil.

Förstärkare

PCR utförs i en förstärkare  - en enhet som ger periodisk kylning och uppvärmning av provrör, vanligtvis med en noggrannhet på minst 0,1 ° C. Moderna cykler låter dig ställa in komplexa program, inklusive möjligheten till "hot start", Touchdown PCR (se nedan) och efterföljande lagring av amplifierade molekyler vid 4 °C. För realtids-PCR produceras enheter utrustade med en fluorescerande detektor. Instrumenten finns också med ett automatiskt lock och mikroplattfack, vilket gör att de kan integreras i automatiserade system.

Reaktionens förlopp

Vanligtvis, när man utför PCR, utförs 20-35 cykler, som var och en består av tre steg. [≡]

Denaturering

Den dubbelsträngade DNA-mallen upphettas till 94-96°C (eller 98°C om ett särskilt värmestabilt polymeras används) i 0,5-2 minuter så att DNA-kedjorna sprids. Detta steg kallas smältning ( denaturering ), eftersom vätebindningarna mellan de två DNA-strängarna bryts. Vanligtvis, före den första cykeln, utförs en lång upphettning av reaktionsblandningen i 2–5 minuter för fullständig denaturering av mallen och primrarna.

Glödgning

När strängarna separeras sänks temperaturen för att tillåta primrarna att binda till den enkelsträngade mallen. Detta stadium kallas glödgning . Glödgningstemperaturen beror på primrarnas sammansättning och väljs vanligtvis 5 grader lägre än primrarnas smälttemperatur. Felaktigt val av hybridiseringstemperatur leder antingen till dålig bindning av primers till mallen (vid förhöjd temperatur) eller till bindning på fel ställe och uppkomsten av ospecifika produkter (vid låg temperatur). Glödgningsstegstid - 30 sekunder Samtidigt, under denna tid, har polymeraset redan tid att syntetisera flera hundra nukleotider. Därför rekommenderas det att välja primers med en smältpunkt över 60°C och utföra glödgning och förlängning samtidigt, vid 60–72°C.

Förlängning

DNA-polymeras replikerar mallsträngen med användning av primern som en primer. Detta är förlängningsstadiet . Polymeraset startar syntesen av den andra strängen från 3'-änden av primern, som har bundit till schablonen, och rör sig längs schablonen och syntetiserar en ny sträng i riktningen från 5'- till 3'-änden. Töjningstemperaturen beror på polymeraset. De vanligen använda Taq- och Pfu- polymeraserna är mest aktiva vid 72°C. Förlängningstiden beror både på typen av DNA-polymeras och på längden av fragmentet som amplifieras. Typiskt tas förlängningstiden till en minut för varje tusen baspar. Efter slutet av alla cykler utförs ofta ett ytterligare steg av slutlig förlängning för att fullborda alla enkelsträngade fragment. Detta skede varar 7-10 minuter.

Mängden av en specifik reaktionsprodukt (begränsad av primers) ökar teoretiskt i proportion till 2n  - 2n, där n är antalet reaktionscykler [17] . Faktum är att effektiviteten för varje cykel kan vara mindre än 100 %, så i verkligheten är P ~ (1 + E) n , där P är mängden produkt, E är den genomsnittliga effektiviteten för cykeln.

Antalet "långa" DNA-kopior växer också, men linjärt, så ett specifikt fragment dominerar i reaktionsprodukterna.

Tillväxten av den erforderliga produkten begränsas exponentiellt av mängden reagens, närvaron av inhibitorer och bildningen av biprodukter. I reaktionens sista cykler saktar tillväxten ner, detta kallas "platåeffekten".

PCR-varianter

• RPA ( Recombinase Polymerase Amplification  - recombinase polymerase amplification ) - används där DNA/RNA-amplifiering behövs inom 15 minuter utan en termisk cykler (isotermisk reaktion) [18] [19] .
• Nested PCR  ( nested PCR ) - används för att minska antalet biprodukter av reaktionen. Använd två par primers och utför två på varandra följande reaktioner. Det andra paret av primrar amplifierar DNA-regionen i produkten från den första reaktionen.
• Inverterad PCR  (invers PCR) - används om endast ett litet område är känt inom den önskade sekvensen. Denna metod är särskilt användbar när det är nödvändigt att bestämma närliggande sekvenser efter att DNA har infogats i genomet. För implementering av inverterad PCR utförs en serie snitt av DNAmed restriktionsenzymerföljt av anslutning av fragment (ligering). Som ett resultat finns kända fragment i båda ändarna av den okända regionen, varefter PCR kan utföras som vanligt.
• Omvänd transkriptions-PCR ( RT-PCR ) används för att amplifiera, isolera eller identifiera en känd sekvens från ett RNA-bibliotek. Före konventionell PCR syntetiseras en enkelsträngad DNA-molekyl på mRNA -mallen med användning av reversetas och ett enkelsträngat cDNA erhålls , som används som en mall för PCR. Denna metod avgör ofta var och närdessa gener uttrycks .
• Asymmetrisk PCR  (asymmetrisk PCR) - utförs när det är nödvändigt att amplifiera huvudsakligen en av kedjorna i det ursprungliga DNA:t. Används i vissasekvenserings-ochhybridiseringsanalystekniker. PCR utförs som vanligt, förutom att en av primrarna tas i stort överskott. En modifiering av denna metod ärLinearAfter - The - Exponential - PCR ( LATE -PCR)matchasmed en högre (smältpunkt) än högkoncentrationsprimern. PCR utförs vid en hög glödgningstemperatur, vilket bibehåller reaktionens effektivitet under alla cykler [20] .
• Kvantitativ PCR ( kvantitativ PCR, Q-PCR ) eller realtids- PCR  ( realtidspolymeraskedjereaktion ) används för att direkt övervaka mätningen av mängden av en viss PCR-produkt i varje reaktionscykel. Denna metod använder fluorescensmärkta DNA-sonder för att analysera ackumuleringen av reaktionsprodukten eller det interkalerande färgämnet SYBR Green (eller dess analoger). Sybr Green I ger ett enkelt och kostnadseffektivt alternativ för realtids-PCR-detektion och kvantifiering av PCR-produkter utan behov av specifika fluorescerande prober eller primers. Under amplifieringinkorporeras SYBR Green I -färgämnet i det mindre spåret i DNA:t hos PCR-produkterna och avger en starkare fluorescerande signal än det obundna färgämnet när det bestrålas med en blå laser. SYBR Green I är kompatibel med alla för närvarande kända realtids-PCR-instrument. Absorptionsmaximum för SYBR Green I är vid en våglängd på 494 nm. Utöver den huvudsakliga finns det två små extra absorptionsmaxima i färgämnesspektrumet, vid 290 nm och 380 nm. Den maximala emissionen för SYBR Green I är vid 521 nm (grön) [21] .
• Steg-PCR (touchdown-PCR) - med detta tillvägagångssätt reduceras påverkan av icke-specifik bindning av primrar. De första cyklerna utförs vid en temperatur över den optimala glödgningstemperaturen, sedan med några få cykler sänks glödgningstemperaturen gradvis till den optimala. Detta för att säkerställa att primern hybridiserar till den komplementära strängen genom hela dess längd; medan vid den optimala hybridiseringstemperaturen hybridiserar primern delvis till den komplementära strängen. Partiell hybridisering av primern på genomiskt DNA leder till ospecifik amplifiering om det finns tillräckligt med bindningsställen för primern. I de flesta fall kan de första tio cyklerna av PCR utföras vid en glödgningstemperatur av 72-75°C och sedan omedelbart sänkas till det optimala, till exempel till 60-65°C.
• Molecular colony method (PCR i gel,koloni PCR) -akrylamidgel polymeriserasmed alla PCR-komponenter på ytan och PCR utförs. Vid punkter som innehåller det analyserade DNA:t sker amplifiering med bildandet av molekylära kolonier.
• PCR med snabb amplifiering av cDNA-ändar (snabb amplifiering av cDNA-ändar, RACE-PCR).
• PCR av långa fragment ( långområde PCR ) är en PCR-modifiering för amplifiering av förlängda DNA-segment (10 tusen eller fler baser). En blandning av två polymeraser används, varav ett är ett Taq- polymeras med hög processivitet (det vill säga kan syntetisera en lång DNA-kedja i en passage), och den andra är ett DNA-polymeras med 3'-5'-exonukleasaktivitet , vanligtvis Pfu- polymeras . Det andra polymeraset är nödvändigt för att korrigera felen som introducerats av det första, eftersom Taq -polymeras stoppar DNA-syntesen om en icke-komplementär nukleotid har lagts till. Denna icke-komplementära nukleotid avlägsnas med Pfu- polymeras. Blandningen av polymeraser tas i ett förhållande av 50:1 eller till och med mindre än 100:1, där Taq- polymeraser tas 25-100 gånger mer än Pfu- polymeraser.
• RAPD ( Random Amplification of Polymorphic DNA ), PCR med slumpmässig amplifiering av polymorft DNA - används när det är nödvändigt att skilja på organismer som ligger nära i genetisk sekvens, till exempel olika sorter av odlade växter, hundraser eller nära relaterade mikroorganismer. Denna metod använder vanligtvis en enda liten primer (ca 10 bp). Denna primer kommer att vara delvis komplementär till slumpmässiga DNA-regioner hos organismerna som studeras. Genom att välja förhållanden (primerlängd, primersammansättning, temperatur etc.) är det möjligt att uppnå en tillfredsställande skillnad i PCR-mönstret för två organismer.
• Gruppspecifik PCR ( gruppspecifik PCR ) - PCR för besläktade sekvenser inom samma eller mellan olika arter med användning av konservativa primrar för dessa sekvenser. Till exempel, valet av universella primrar för 18S- och 26S- ribosomalgenerna för amplifiering av en artspecifik intergenisk spacer: sekvensen av 18S- och 26S- generna bevaras mellan arter, så PCR mellan dessa gener kommer att äga rum för alla arter under studie. Motsatsen till denna metod är unik PCR ( unik PCR ), där uppgiften är att välja primrar för att amplifiera endast en sekvens från alla relaterade.
• PCR med varmstart (hetstart PCR) är en modifiering av PCR med användning av DNA-polymeras, där polymerasaktivitet blockeras vid rumstemperatur av antikroppar eller små molekyler som simulerar antikroppar som Affibody , det vill säga vid tidpunkten för inställning av reaktionen före den första denatureringen i PCR. Typiskt utförs den första denatureringen vid 95°C under 10 minuter.
• Virtuell PCR ( in silico PCR , elektronisk PCR, e-PCR) är en matematisk metod för datoranalys av en teoretisk polymeraskedjereaktion med hjälp av en lista med primersekvenser (eller DNA-sonder ) för att förutsäga potentiell DNA- amplifiering av genomet , kromosomen , cDNA eller någon annan region under studie-DNA.

Om nukleotidsekvensen för mallen är delvis känd eller inte känd alls, kan degenererade primrar användas , vars sekvens innehåller degenererade positioner i vilka alla baser kan lokaliseras. Till exempel kan primersekvensen vara: ...ATH... där H är A, T eller C.

Tillämpning av PCR

PCR används inom många områden för analys och i vetenskapliga experiment.

Criminalistics

PCR används för att jämföra så kallade "genetiska fingeravtryck". Ett prov av genetiskt material från brottsplatsen behövs - blod, saliv, sperma, hår etc. Det jämförs med den misstänktes genetiska material. En mycket liten mängd DNA räcker teoretiskt sett - en kopia. DNA:t skärs i fragment och amplifieras sedan med PCR. Fragment separeras med hjälp av DNA-elektrofores . Den resulterande bilden av platsen för DNA-banden kallas det genetiska fingeravtrycket .

Fastställande av faderskap

Även om "genetiska fingeravtryck" är unika, kan familjeband fortfarande etableras genom att göra flera sådana fingeravtryck. [≡] Samma metod kan tillämpas, med liten modifiering, för att etablera evolutionära relationer mellan organismer.

Medicinsk diagnostik

PCR gör det möjligt att avsevärt påskynda och underlätta diagnostisering av ärftliga och virussjukdomar . Den önskade genen amplifieras med PCR med användning av lämpliga primrar och sekvenseras sedan för att bestämma mutationer . Virusinfektioner kan upptäckas omedelbart efter infektion, veckor eller månader (beroende på längden på inkubationsperioden ) innan symtom på sjukdomen uppträder.

Personlig medicin

Ibland är läkemedel giftiga eller allergiframkallande för vissa patienter. Orsakerna till detta är delvis individuella skillnader i känslighet och metabolism av läkemedel och deras derivat. Dessa skillnader bestäms på genetisk nivå. Till exempel, hos en patient kan ett visst cytokrom (ett leverprotein som ansvarar för metabolismen av främmande ämnen) vara mer aktivt, i en annan - mindre aktivt. För att avgöra vilken typ av cytokrom en given patient har, föreslås att man gör en PCR-analys innan man använder läkemedlet. Denna analys kallas preliminär genotypning ( prospektiv genotypning ).

Genkloning

Genkloning (inte att förväxla med kloning av organismer) är processen att isolera gener och, som ett resultat av genmanipulationer , erhålla en stor mängd av produkten från en given gen. PCR används för att amplifiera en gen, som sedan sätts in i en vektor  , en bit av DNA som överför en främmande gen till samma eller en annan organism som är lätt att odla. Som vektorer används till exempel plasmider eller viralt DNA. Införandet av gener i en främmande organism används vanligtvis för att erhålla en produkt av denna gen - RNA eller, oftast, ett protein. På så sätt erhålls många proteiner i industriella mängder för användning inom jordbruk, medicin m.m.

DNA-sekvensering

I sekvenseringsmetoden som använder dideoxinukleotider märkta med en fluorescerande märkning eller en radioaktiv isotop , är PCR en integrerad del, eftersom det är under polymerisation som derivat av nukleotider märkta med en fluorescerande eller radioaktiv märkning infogas i DNA-kedjan. Tillsatsen av en dideoxinukleotid till den syntetiserade strängen avslutar syntesen, vilket gör att positionen för specifika nukleotider kan bestämmas efter separation i gelén.

Mutagenes

För närvarande har PCR blivit den huvudsakliga metoden för att utföra mutagenes (införa förändringar i nukleotidsekvensen av DNA). Användningen av PCR gjorde det möjligt att förenkla och påskynda mutagenesproceduren, samt att göra den mer tillförlitlig och reproducerbar.

Molekylär könsbestämning

Ett annat område för praktisk tillämpning av PCR är molekylär könsbestämning  — könsbestämning baserad på könsskillnader på DNA-nivå mellan män och kvinnor [22] .

Se även

• Nicking enzymmedierad amplifiering
• Helikasberoende förstärkning
• DNA
• Immuno-PCR
• Användning av DNA i teknik
• Nästa generations sekvenseringsmetoder
• Sekvensering
• RNA-sekvensering
• SlipChip-teknik
• elektrofores
• DNA-elektrofores
• FastPCR
• PCR i realtid

Anteckningar

1. ↑ Kleppe, K. et al. (1971): Studier av polynukleotider. XCVI. Reparera replikationer av korta syntetiska DNA som katalyseras av DNA-polymeraser. I: J. Mol. Biol. bd. 56, S. 341-361. PMID 4927950
2. ↑ Bartlett, JMS; Stirling, D. A Short History of the Polymerase Chain Reaction // PCR-protokoll  (obestämd) . — 2:a. - 2003. - T. 226. - S. 3-6. — (Methods in Molecular Biology). — ISBN 1-59259-384-4 . - doi : 10.1385/1-59259-384-4:3 .
3. ↑ Mullis, Kary B. et al. "Process för att amplifiera, detektera och/eller klona nukleinsyrasekvenser" US Patent 4 683 195
4. ↑ Saiki RK, Scharf S., Faloona F., Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N. Science 1985 Dec 20; 230 (4732): 1350-4; Enzymatisk amplifiering av beta-globin genomiska sekvenser och restriktionsplatsanalys för diagnos av sicklecellanemi.
5. ↑ [ Nobelpristagare i kemi 1993  ] . Hämtad 29 augusti 2007. Arkiverad från originalet 26 oktober 2012.  (obestämd) Nobelpristagare i kemi, 1993  (engelska) ]
6. ↑ RK Saiki, DH Gelfand, S. Stoffel, SJ Scharf, R. Higuchi, GT Horn, KB Mullis, HA Erlich. Primer-riktad enzymatisk amplifiering av DNA med ett termostabilt DNA-polymeras Arkiverad 19 december 2008 på Wayback Machine . i: Vetenskap . 239.1988, 487-491. ISSN 0036-8075 PMID 2448875
7. ↑ Kaledin A. S., Slyusarenko A. G., Gorodetsky S. I. // Biochemistry. - 1980. - T. 45. - C. 644-651.
8. ↑ Alice Chien, David B. Edgar och John M. Trela. Deoxiribonukleinsyrapolymeras från Extreme Thermophilic Thermus aquaticus. Tidskrift för bakteriologi, sept. 1976, sid. 1550-1557.
9. ↑ Roche tillkännager förlikningsavtal med Promega (nedlänk) . Hämtad 29 augusti 2007. Arkiverad från originalet 6 oktober 2008. (obestämd) 
10. ↑ 1 kbp ( engelska  kilo baspar ) - 1 tusen baspar, en måttenhet för DNA- längd
11. ↑ Venter J, et al. (2001). Sekvensen av det mänskliga genomet. Science 291 (5507): 1304-51. PMID 11181995
12. ↑ {titel} (nedlänk) . Hämtad 1 september 2007. Arkiverad från originalet 29 september 2007. (obestämd) 
13. ↑ Annealing ( annealing ) - hybridisering av DNA-fragment
14. ↑ Nicolas von Ahsen, Carl T. Wittwer, Ekkehard Schütz. Oligonukleotidssmälttemperaturer under pcr-förhållanden: korrigeringar av närmaste granne för Mg 2+ , deoxinukleotidtrifosfat- och dimetylsulfoxidkoncentrationer med jämförelse med alternativa empiriska formler  //  Clinical Chemistry: journal. - 2001. - Vol. 47 , nr. 11 . - P. 1956-1961 . Arkiverad från originalet den 1 september 2012.
15. ↑ Hårnål  - intramolekylär självkomplementär struktur
16. ↑ Dimer  - intermolekylära strukturer bildade av primers med varandra eller med sig själva
17. ↑ Kalender R. N., Sivolap Yu. M. Polymeraskedjereaktion med godtyckliga primers  // Biopolymerer och cell: journal. - 1995. - T. 11 , nr 3-4 . - S. 55-65 . — ISSN 0233-7657 . (ryska)
18. ↑ Recombinase Polymerase Amplification (RPA) - den isotermiska DNA/RNA-amplifieringen som verkligen fungerar. . Hämtad 9 september 2017. Arkiverad från originalet 9 september 2017. (obestämd)
19. ↑ Video på engelska: Vad är Recombinase Polymerase Amplification? — TwistDx Arkiverad 24 november 2016 på Wayback Machine
20. ↑ Pierce KE och Wangh LJ Linjär-efter-exponentiell polymeraskedjereaktion och allierade teknologier Realtidsdetekteringsstrategier för snabb, tillförlitlig diagnos från enstaka celler  //  Metoder Mol Med. : journal. - 2007. - Vol. Metoder inom molekylär medicin™ . - S. 65-85 . — ISBN 978-1-58829-578-1 . - doi : 10.1007/978-1-59745-298-4_7 . — PMID 17876077 .
21. ↑ Fluorescence SpectraViewer Fluorescence SpectraViewer | Livstekniker . Datum för åtkomst: 30 oktober 2012. Arkiverad från originalet den 15 november 2012. (obestämd)
22. ↑ Romanov MN, Ellegren H., Dodgson JB (2001-01-13). Polymeraskedjereaktionsförstärkta markörer för könsbestämning av fåglar . International Plant and Animal Genome IX Conference (San Diego, 13–17 januari 2001) . San Diego, CA, USA: Scherago International. sid. 118.OCLC 899128222  . _ Sammanfattning P229. Arkiverad från originalet 2020-09-20 . Hämtad 2020-10-26 . Utfasad parameter används |deadlink=( hjälp ) (Engelsk)

Litteratur

• Glick B., Pasternak J. Molecular biotechnology. Principer och tillämpning. Per. från engelska. - M .: Mir, 2002. - 589 s., ill. — ISBN 5-03-003328-9
• Patrushev L. I. Artificiella genetiska system. - M .: Nauka, 2005. - I 2 volymer - ISBN 5-02-033278-X
• Shchelkunov S. N. Genteknik. - Novosibirsk: Sib. univ. förlag, 2004. - 496 s.; sjuk. — ISBN 5-94087-098-8
• Ahsen N, Wittwer CT, Schutz E 2001. Smälttemperaturer för oligonukleotider under PCR-förhållanden: Korrektioner av närmaste granne för Mg 2+ , deoxinukleotidtrifosfat- och dimetylsulfoxidkoncentrationer med jämförelse med alternativa empiriska formler, arkiverad 1 september 20, 12 september . Clin Chem , 47:1956-1961.
• Kalendar R, Lee D, Schulman AH 2011. Java webbverktyg för PCR, i silico PCR, och oligonukleotid montering och analys . Genomics, 98(2): 137-144. http://primerdigital.com/tools/ Arkiverad från originalet den 16 september 2012.

Länkar

• Verksamhet vid PCR-laboratoriet. Organisation av arbetet under PCR-studier av material infekterat med mikroorganismer av patogenicitetsgrupp I-II Arkivexemplar daterad 29 september 2010 på Wayback Machine .
• Webbplatsen "Classical and Molecular Biology": Tekniker relaterade till PCR Arkiverad 8 juni 2007 på Wayback Machine

Ordböcker och uppslagsverk	Stor dansk stor kines stor kines stor kines Stor ryss runt världen Britannica (online) Brockhaus Universalis Universalis
I bibliografiska kataloger	BNF : 121493620 GND : 4256726-9 J9U : 987007546303405171 LCCN : sh89002539 NKC : ph907888