V(D)J-rekombination [1] eller V(D)J-omarrangemang [2] ( eng. V(D)J-rekombination, V(D)J omarrangering ), är en mekanism för somatisk DNA- rekombination som förekommer i tidiga stadier av differentiering av lymfocyter och leder till bildandet av antigen -igenkännande sektioner av antikroppar och T-cellsreceptorn . Generna av immunglobuliner ( engelska Ig ) och T-cellsreceptorer ( engelska TCR ) består av repeterande segment som tillhör tre klasser: V (från engelsk variabel ), D (från engelsk diversity ) och J (från engelska .joining ) . Under V(D)J-omarrangemanget sammanfogas gensegment, ett från varje klass. Den kombinerade sekvensen av V(D)J-segment kodar för de variabla domänerna för var och en av receptor- eller antikroppskedjorna [2] .
En antikropp (immunoglobulin) molekyl är en tetramer av två identiska tunga (H-kedjor) och två identiska lätta kedjor (L-kedjor). Varje kedja har en N-terminal variabel region (variabel eller V-domän) och en konstant region (konstant eller C-domän) vid C-terminalen . Den variabla domänen är involverad i antigenigenkänning , och C-domänen är ansvarig för effektorfunktioner. Som namnet antyder är aminosyrasekvensen för V -domänen variabel, medan C-domänen visar en uttalad konservatism . Den maximala variabiliteten manifesteras just i regionen som är ansvarig för antigenbindning [3] . Det antigenbindande stället bildas av V-domäner av tunga och lätta kedjor ( VH- respektive VL - domäner) [4] . L -kedjan innehåller en C-domän (betecknad CL ), och H-kedjan innehåller 3 eller 4 domäner, som betecknas CH 1, CH 2, CH 3, CH 4. C-domäner är inte involverade i antigenigenkänning och är nödvändiga för interaktion med immuncellsreceptorer , aktivering av komplementsystemet och andra effektorfunktioner [5] .
Till skillnad från de flesta gener är immunglobulin- och T-cellsreceptorgener inte närvarande som en helhet i könsceller och somatiska celler . Bildandet av en enda gen som kodar för V- och C-domänerna sker genom en (i fallet med lätta kedjor) eller två (i fallet med tunga kedjor) handlingar av somatisk rekombination. V-domäner och C-domäner kodas av separata segment av V-genen respektive C-genen, och de kan inte uttryckas ensamma: i detta system kodar två "gener" för en enda polypeptid - en lätt eller tung kedja. Vilket som helst av ett flertal V-gensegment kan kopplas till vilket som helst av flera C-gensegment. Lätta kedjor bildas som ett resultat av en enda rekombinationshandling. Det finns två typer av lätta kedjor: κ och λ. Den lätta kedjan λ bildas genom rekombination mellan Vλ -genen och JλCλ - segmentet . Bokstaven J förkortas som den plats med vilken V λ- segmentet är anslutet , det vill säga kopplingsreaktionen sker inte direkt mellan V λ- och C λ -segmenten, utan genom J λ- segmentet . Detta segment kodar för flera aminosyrarester (a.o.) av den variabla regionen och i genen som bildas genom rekombination är VX - JX- segmentet en enda exon som kodar för hela den variabla regionen. I fallet med en lätt kedja av κ-typ är kedjan också sammansatt av två segment, men efter Vk -genen följer en grupp av fem segment Jk , som är separerade från exonen C κ med en intron 2 till 3 tusen baspar långa . Under rekombination kan Vk- segmentet förenas med vilket som helst av Jk- segmenten, och det intakta variabla exonet består slutligen av Vk- och Jk- segmenten . J κ -segment som ligger till vänster om det rekombinerande J κ -segmentet tas bort, och J κ -segment till höger om det rekombinerande segmentet blir en del av intronet mellan de variabla och konstanta exonerna [6] .
Tunga kedjor bildas som ett resultat av inte en, utan två rekombinationshandlingar, och element som VH -genen, D-segmentet och VHCH - gensegmentet är involverade i deras bildning. D-segmentet är en sektion av 2-13 a. o., separering av sekvenserna som kodar för VH -segmentet och JH -segmentet. Platsen för D-segmenten på kromosomen är också belägen mellan uppsättningarna av VH - segment och JH - segment. Kombinationen av VH-DJH sker i två steg: först kopplas ett av D-segmenten till JH- segmenten, och sedan rekombinerar VH - segmentet med det kombinerade DJH - segmentet . Den resulterande sekvensen av tre VH-DJH - element samuttrycks med CH-genen , som är belägen till höger om VH-DJH och inkluderar fyra exoner. Hos människor innehåller D- segmentlokuset 30 D-segment i tandem , följt av ett kluster av 6 JH- segment . Hur det säkerställs att samma D-segment deltar i DJ H- och VH - DJ H - rekombinationshändelserna är fortfarande okänt. Med namnet på de individuella elementen kallades processen att sätta ihop ett enda lokus som kodar för en lätt eller tung kedja V(D)J-rekombination [7] .
T -cellsreceptorn ( TCR ) är en heterodimer av två underenheter : α och β (TCRαβ-receptor) eller γ och δ (TCRγδ-receptor), som kodar för TCRA-, TCRB-, TCRG- respektive TCRD-generna. Även om sekvenserna som kodar för TCR δ-kedjan är belägna inom a-kedjegenen, anses de vanligtvis vara ett distinkt genetiskt kluster . Som i fallet med immunglobuliner inkluderar T-cellsreceptorn konstanta domäner och C-gener som kodar för dem, V-domäner som kodar för V-gener och J-segment som separerar kluster av C-gener och V-gener (i TCRB och V-gener). TCRD-gener även D-segment är närvarande). Under bildandet av var och en av de fyra möjliga TCR-kedjorna sker också V(D)J-rekombination [8] . När det gäller TCRB- och TRCD-gener som innehåller D-segment, sker rekombination i två steg (först mellan D- och J-segment, sedan mellan DJ- och V-segment), och i fallet med TCRA och TRCG, i ett steg [9] .
Således är endast sju genloci föremål för V(D)J-omlagring: den tunga kedjan av immunglobulin (IgH), lätta kedjor κ och λ, såväl som fyra T-cellsreceptorgener som kodar för kedjorna α, β, γ, δ: TCRA, TCRB, TCRG respektive TCRD. D-segment finns endast i immunglobulin-genen för tung kedja, TCRB och TCRD [10] .
V-gener av alla polypeptidkedjor involverade i antigenigenkänning genomgår omarrangemang, men inte samtidigt, utan sekventiellt. I B-celler omarrangeras generna av tung kedja först och sedan generna av lätt kedja (lätta kedjor av K-typ omarrangeras först, sedan lätta kedjor av A-typ). I T-celler , under bildningen av TCRαβ-generna, omarrangeras först β- och sedan α-kedjegenerna. I fallet med TCRγδ sker omarrangemanget av generna i de variabla domänerna av γ- och δ-kedjorna nästan samtidigt [11] .
V(D)J-rekombination fortsätter till fullbordan endast i T- och B-celler under påverkan av differentieringssignaler från den yttre miljön. De initiala stadierna av omarrangemang i form av DJ-rekombination kan också förekomma i celler som inte är relaterade till T- och B-celler, till exempel naturliga mördare , som är nära till ursprunget T-celler [12] . Den molekylära mekanismen för V(D)J-rekombination av alla sju loci av immunglobuliner eller T-cellsreceptorer är identisk [13] . Sekvensen av V(D)J-rekombinationsreaktioner beskrivs i föregående avsnitt, och de molekylära mekanismerna för V(D)J-rekombination kommer också att beskrivas här.
Rekombination sker vid DNA-signalsekvenser omedelbart intill gensegment. Dessa konserverade sekvenser kallas rekombinationssignalsekvenser ( engelska rekombinationssignalsekvensen , RSS) och består av sju nukleotider - 5'-CACAGTG-3' ( heptamer ), följt av en sekvens på 12 eller 23 nukleotider - en spacer , och mer ett konservativt block av nio nukleotider - 5'-ACAAAAACC-3' (nonamer). Sekvensen för spacern kan variera, men längden är konservativ och motsvarar en (12 nukleotider) eller två (23 nukleotider) varv av DNA -dubbelhelixen Omarrangemang sker endast mellan två RSS, varav den ena har en 12 baspar (bp) distans, den andra har en 23 bp distans, den så kallade "12/23 rekombinationsregeln". Detta mönster av RSS-struktur bestämmer den korrekta rekombinationssekvensen: till exempel har IGH-lokuset en 23 bp RSS. vid 3'-änden av varje V-segment, RSS 12 bp lång. vid 3'- och 5'-ändarna av varje D-segment och en 23 bp RSS. vid 5'-änden av varje J-segment. Sålunda är VJ-omarrangering av detta lokus inte möjlig. Arrangemanget av konsensussekvenser i V- eller J-segment kan vara vilket som helst, det vill säga olika spacers tjänar endast till att förhindra rekombination av V- eller J-segmentet med samma segment och har ingen signifikant information [14] .
Proteinerna RAG1 och RAG2 ( rekombinationsaktiveringsgener ) är nödvändiga och tillräckliga för att introducera DNA-avbrott under V(D)J-rekombination . Möss som saknar generna RAG1 och RAG2 har bara omogna T- och B-celler eftersom de inte kan bilda funktionella antikroppar och T-cellsreceptorer. RAG1 känner igen signalsekvenser med motsvarande 12 eller 23 bp spacers. och rekryterar RAG2 till reaktionskomplexet. Signalsekvens på 9 p. är platsen för primär igenkänning och sekvensen på 7 bp. indikerar platsen för snittet. Som ett resultat av dimerisering av RAG1 och RAG2 närmar sig sekvenserna associerade med dem varandra, vilket också underlättas av komplementära interaktioner mellan signalsekvenser, som är möjliga på grund av deras palindromicitet . HMG1/2-heterodimeren deltar också i konvergensen av sekvenser relaterade till RAG1 och RAG2. RAG1/2-komplexet introducerar ett enda strängbrott vid var och en av de två regionerna som kommer att förenas genom rekombination. I ändarna av var och en av de två enkelsträngsbrytningarna finns en 5'-terminal fosfatgrupp och en 3'-terminal hydroxylgrupp (3'-OH). 3'-OH som ligger intill det kodande segmentet angriper fosfodiesterbindningen vid lämplig position på andra sidan av DNA-duplexet. Som ett resultat av denna reaktion bildas en hårnål vid platsen för varje enkelsträngsbrott , där 3'-änden av en av de två strängarna i DNA-helixen är kovalent kopplad till 5'-änden av den andra strängen i duplexet. Hårnålarna i ändarna av de kodande segmenten känns igen av en heterodimer av Ku70- och Ku80 -proteinerna , och Artemis -proteinet öppnar hårnålarna. Vidare är ändarna av de kodande segmenten förbundna med samma mekanism som i den icke-homologa anslutningen av ändarna under DNA-reparation . Om ett DNA-kedjebrott inträffar nära änden av hårnålen, bildas en lång enkelsträngad region i slutet av det kodande segmentet. Därefter fullbordas en kedja som är komplementär till den, och flera ytterligare nukleotider introduceras i regionen i slutet av det kodande segmentet, vilka bildar en sekvens som är palindromisk med avseende på originalet (därför kallas de P-nukleotider från engelskan palindromisk ). Ytterligare nukleotider mellan de kodande segmenten kan också komma från en annan process. Enzymet terminala deoxinukleotidyltransferas (TdT) introducerar en liten mängd (upp till 20, vanligtvis mindre än 10) ytterligare slumpmässiga nukleotider (N-nukleotider) mellan ändarna av segmenten, varefter de ligeras i en icke-homolog ändbindningsväg [15] . Den klippta sektionen som innehåller RSS-signalsekvenserna stängs för att bilda en ringformad struktur känd som en rekombinationsexcisionscirkel (REC från engelskan. Recombination excision circle ) [9] .
Återföreningen av ändarna av de kodande segmenten sker genom mekanismen för icke-homolog ändsammanfogning med deltagande av enzymerna DNA-ligas IV, DNA-beroende proteinkinas , proteiner Ku70/Ku80, XRCC4 och icke- homolog ändkopplingsfaktor 1 [16] . Detta fullbordar sammansättningen av genen som kodar för immunglobulinkedjan eller TCR. DNA-beroende proteinkinas är involverat i aktiveringen av Artemis hårnålsupplösande protein genom fosforylering [17] . Kombinationen av proteinerna RAG1, RAG2, DNA-beroende proteinkinas, DNA-ligas IV, TdT, HMG1/2 och Ku70/Ku80 kallas V(D)J-rekombinationskomplexet [18] .
Tack vare V(D)J-rekombination skapas en enorm mängd antikroppar i kroppen hos ett ryggradsdjur . Enbart ett tungkedjelokus kan ge upphov till mer än 108 olika kombinationer av VH -JH- CH . Lätta kedjeställen kan ge upphov till cirka en miljon rekombinerade kedjor av λ- eller κ-typ [19] . Hela spektrat av antikroppar i blodet 2008 föreslog George Church att kalla termen V(D)J-th [20] .
I vissa fall kan V(D)J-rekombination leda till inversioner eller deletioner . Så, ibland i loci av lätta kedjor av λ-typ, har V λ-segmentet en orientering på kromosomen som är motsatt orienteringen av J λ -C λ -lokuset , och brottet och återföreningen i detta fall kommer att leda till inversion av det deleterade stället med signalsekvenser istället för dess excision från kromosomen (deletion). De funktionella konsekvenserna av inversionen för immunsystemet skiljer sig inte från de av deletionen. Rekombination via inversion sker vid TCR-loci, tunga kedjor och lätta kedjor av K-typ [21] .
När omarrangemanget av en viss V-gen är framgångsrik, upphör uttrycket av RAG -generna och genen på den homologa kromosomen förblir orearrangerad och fungerar inte. Ungefär två tredjedelar av misslyckade V(D)J-rekombinationshändelser beror på ramförskjutning . Om omarrangemanget misslyckas börjar V(D)J-rekombinationen på den homologa kromosomen, och om den fullbordas framgångsrikt, förblir genen på den homologa kromosomen den enda fungerande, det vill säga allelisk uteslutning inträffar . I 45 % av fallen misslyckas V(D)J-rekombinationen på lymfocytens båda kromosomer , och den dör av apoptos . När det gäller αβ-TCR, när omarrangemanget av α-kedjegenen misslyckas, startar redigeringsprocessen om och RAG -genen återuttrycks. Rekombinationen fortsätter med deltagande av Va-segmentet, som inte skars ut från kromosomen och inte kom in i excisionsringen. Processen kan upprepas tills en funktionell gen som kodar för den lätta kedjan genereras. Under graviditeten eller när en T-cell känner igen ett självantigen kan redigering av α-kedjegenen inträffa . Om α-kedjegenen redigeras, som är i könslinjekonfigurationen på den andra kromosomen av ett par homologer, kan en situation uppstå som bryter mot den alleliska uteslutningsregeln: i en T-cell kommer det att finnas två TCR med samma β-kedjor, men olika α-kedjor [22] .
Brott mot V(D)J-rekombination leder till utveckling av immunbristtillstånd . Vid allvarligt kombinerat immunbristsyndrom är nivån av V(D)J-rekombination i loci som kodar för immunglobuliner och T-cellsreceptorer mycket låg. Svårt kombinerat immunbristsyndrom orsakas av mutationer som gör icke-funktionella V(D)J-rekombinationsproteiner: RAG1, RAG2, Artemis eller DNA-beroende proteinkinas [23] [17] .
Baserat på data om närvaron av konstanta och variabla domäner i immunglobulinmolekylen föreslog Dreyer och Bennett 1965 att två gener, V och C, är involverade i konstruktionen av en enda tung eller lätt immunglobulinkedja [24] . 1976 påbörjade Suzumi Tonegawa en serie experiment och visade att generna som kodar för antikroppar genomgår omarrangemang som skapar en enorm mängd antikroppar [25] . 1987 fick Tonegawa Nobelpriset i fysiologi eller medicin för att ha upptäckt mekanismerna för antikroppsmångfald [26] .
| Lymfocyt adaptivt immunsystem och komplement | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Lymfoid |
| ||||||||
| Lymfocyter | |||||||||
| Ämnen | |||||||||