Lipidflottar är speciella regioner (mikrodomäner) i plasmamembranet anrikade på glykosfingolipider och kolesterol [1] [2] [3] [4] [5] . Dessa platser koordinerar cellulära processer, påverkar membranfluiditet , fungerar som organiserande centra för montering av signalmolekyler , reglerar rörelsen av membranproteiner , receptorer och reglerar även neurotransmission [5] [6] . Lipidflottar är mer strukturerade och tätare än deras omgivande lipiddubbelskikt ; samtidigt kan de röra sig fritt i den [7] .
Fram till 1982 trodde man allmänt att fosfolipider och membranproteiner var slumpmässigt fördelade i cellmembranet - i enlighet med mosaikmodellen cellmembranets struktur, som föreslogs 1972 av S. J. Singer och G. Nicholson [6] [8] . Modellen antog att membranproteiner "simmar" i ett homogent lipidhav [9] .
På 1970-talet bevisade dock A. Stir och E. Zakman, liksom M. J. Karnovsky och kollegor, med hjälp av fysiska metoder, existensen av speciella membranmikrodomäner [10] [11] . Förekomsten av dessa mikrodomäner har förklarats av de fysikaliska egenskaperna och organisationen av lipidblandningar [12] . 1974 antydde observation av temperaturens effekt på membranbeteende förekomsten av "lipidkluster" i membran, och 1975 upptäcktes det att dessa kluster kan representera "kvasikristallina" regioner belägna inom mer flytande lipidregioner. 1978 gav studier med röntgenspridning en ny impuls till utvecklingen av idén om "kluster" och gjorde det möjligt att definiera mikrodomäner som "lipider i ett mer ordnat tillstånd" 1982 formulerade Karnovsky och medarbetare konceptet med lipiddomäner i membranet. Deras studier fastställde heterogenitet i fluorescenslivslängden för 1,6-difenyl-1,3,5-hexatrienmolekyler , vilket indikerar närvaron av flera lipidfaser i membranet [6] . En typ av sådana mikrodomäner bildas av kolesterol och sfingolipider . De bildas som ett resultat av isoleringen av dessa lipider i en separat fas, vilket visades experimentellt [13] . Man fann också att sådana mikrodomäner ("flottar") också finns i cellmembran [14] .
Som ett resultat bildades gradvis ett nytt koncept av strukturen av cellmembranet, vilket återspeglar dynamisk omstrukturering med bildandet av högnivåmolekylära kluster [9] . Termen "lipidflottar" föreslogs först 1988 av C. Simons och G. van Meer [15] . De tillämpade termen ( eng. lipid raft 'lipid raft') på områden med tätt packad lipid som flyter på ytan av en mer flytande fosfolipid [9] . Inledningsvis användes konceptet flottar för att förklara transporten av kolesterol från trans Golgi- apparaten till plasmamembranet. Denna idé introducerades först av Simons och E. Ikonen 1997 [16] . 2006, vid Keystone Symposium of Lipid Rafts and Cell Function , definierades lipidflottar som "små (10–200 nm), heterogena, mycket dynamiska domäner berikade med steroler och sfingolipider som uppdelar cellulära processer. Små flottar kan ibland kombineras till större genom protein-protein-interaktioner." Nyligen har många kontroversiella artiklar publicerats angående lipidflottar; storleken och tiden för existensen av lipidflottar kan tillskrivas antalet kontroversiella punkter (för mer information , se Tvister kring lipidflottar ).
Hittills är följande frågor om lipidflottar obesvarade [6] :
En av huvudskillnaderna mellan lipidflottar och plasmamembranet är deras lipidsammansättning. Studier har visat att lipidflottar innehåller 3-5 gånger mer kolesterol än det omgivande lipiddubbelskiktet [17] . Dessutom är lipidflottar berikade med sfingolipider - till exempel sfingomyelin , vars innehåll i lipidflottar vanligtvis är 50% högre än i plasmamembranet. Det finns praktiskt taget inga glycerofosfolipider i flottar [2] . För att kompensera för det ökade innehållet av sfingomyelin minskas andelen fosfatidylkolin i lipidflottar, vilket resulterar i att andelen kolininnehållande lipider i dem också är nästan 50% lägre jämfört med det omgivande membranet. Kolesterol interagerar företrädesvis med sfingolipider (men inte bara med dem), på grund av deras struktur och graden av mättnad av deras kolvätekedjor . Även om inte alla fosfolipider i flotten är helt mättade, är deras hydrofoba acylgrupper mer mättade och tätare än de i de omgivande dubbelskiktslipiderna [6] .
Kolesterol fungerar som ett dynamiskt "lim" som håller ihop flottens lipider [5] och fyller alla tomrum mellan dem. På grund av sterolgruppens stela natur finns kolesterol företrädesvis i flottar, där de långa, mättade sfingolipidacylsvansarna kan bilda tätare och starkare bindningar till dess ringsystem än de kortare och ofta omättade fosfolipidsvansarna i det omgivande dubbelskiktet. Av denna anledning är lipidflottar mindre flytande än resten av dubbelskiktet [2] .
Vissa forskare tillskriver utseendet av flottar i modellmembran till separationen av membranet i ordnade (Lo-fas) och oordnade (Ld- eller La-fas) vätskefaser [18] . Orsakerna till denna separation i faser är oklara, men deras oblandbarhet minimerar uppenbarligen den fria energin i dessa två faser. Det har visat sig att lipidflottar och det omgivande membranet har olika tjocklek på grund av att kolvätekedjorna i sfingolipider är längre och rakare än i andra membranlipider [1] . Detta leder till det faktum att de hydrofoba skikten av flottarna och resten av dubbelskiktet inte förenar varandra vid gränsen mellan två faser. Det har visat sig att denna skillnad i tjocklek ökar ytspänningen vid gränsytan mellan de två faserna, vilket resulterar i större flottar med rundade gränser och därigenom minimerar energikostnaden för att hålla flottarna som separata faser. Andra spontana händelser, som membranböjning eller sammanslagning av små flottar till större, kan också minimera spänningen vid fasgränsen [6] .
På grund av sin struktur och motståndskraft mot nonjoniska detergenter [2] såsom Triton X-100 eller Brij-98, kallas lipidflottar också tvättmedelolösliga glykolipidberikade komplex ( GEMs ) eller DIGs ) [19] eller Detergent Resistant Membranes (DRM) ) . Denna egenskap hos lipidflottar kan användas för att uppskatta andelen av cellytan som upptas av flottar från den fraktion som är resistent mot detergentsolubilisering . I vissa fall kan det vara 50 %. Indirekta mätningar av flottars storlek gör det möjligt att grovt uppskatta diametern på en flotte vid 50 nm [20] (det finns dock andra åsikter i denna fråga, se Tvister kring lipidflottar ).
Lipidflottar är extremt rika på integrerade membranproteiner av två klasser: den ena är förankrad i membranet av två långkedjiga mättade fettsyror (två palmitoyl- eller palmitoyl- och myristoylgrupper ) kovalent kopplade till dessa proteiner , och den andra av en glykosylfosfatidylinositol (GPI) -) ankare. Det finns ett konstant utbyte mellan flottens proteiner och resten av dubbelskiktet: membranproteiner kan komma in och ut ur flottarna inom några sekunder . Det bör noteras att för en process där två membranproteiner interagerar, ökar deras samtidiga närvaro i samma flotte avsevärt sannolikheten för deras kollision. Därför separeras vissa membranreceptorer och signalproteiner tillsammans exakt i membranflottar, och signalöverföringen genom dessa proteiner kan avbrytas av manipulationer som tar bort kolesterol från membranet och förstör flottar; sålunda är lipidflottar involverade i många cellsignaleringsvägar [20] .
Två typer av lipidflottar har föreslagits: plana (även känd som icke -kaveolära eller glykolipidflottar ) och kaveolära lipidflottar. Plana lipidflottar ligger i plasmamembranets plan (bildar inte invaginationer) och har inga distinkta morfologiska egenskaper. Kaveolflottar, tvärtom, bildar kolvformade utsprång i plasmamembranet som innehåller proteinet caveolin , som är en del av speciella membranfördjupningar - kaveoler ; de flesta observerade flottarna är av denna typ. Caveoliner är starkt uttryckta i hjärnan , mikrokärl i nervsystemet , endotelceller , astrocyter , oligodendrocyter , Schwann-celler , spinalganglier och hippocampus neuroner . Plana flottar innehåller proteinet flotillin och finns i neuroner som saknar kaveoler. Båda typerna av flottar har en liknande lipidsammansättning (berikad med kolesterol och sfingolipider). Flotillin och caveolin har förmågan att rekrytera signalmolekyler till lipidflottar och spelar därmed en viktig roll i signalsubstansförmedlad signalering . Det har föreslagits att dessa mikrodomäner är ansvariga för den rumsliga organisationen av signalmolekyler på ett sådant sätt att de underlättar de kinetiskt gynnsamma interaktioner som krävs för signaltransduktion. Men samma mikrodomäner separerar signalmolekylerna, undertrycker onödiga interaktioner och leder till signalförsvagning [21] .
Termen "signalering" hänvisar till varje process genom vilken en cell omvandlar en typ av signal eller stimulans till en annan. Signalen eller stimulansvägen kan vara enkel, vilket är fallet med receptormolekyler. Mer komplex signaltransduktion involverar inblandning av ligand -receptorkomplex i många intracellulära processer, såsom fosforylering av tyrosinkinaser eller serin-treoninkinaser [22] . Specificiteten och noggrannheten för signalöverföring är avgörande för ett effektivt cellsvar på miljöförändringar . Detta uppnås delvis genom olika lokalisering av proteiner involverade i signalvägar. I plasmamembranet utförs denna kompartmentalisering delvis av lipidflottar [23] .
Ett av de viktiga bevisen till förmån för förekomsten av lipidflottar är deras arbete som plattformar på vilka individuella receptorer koncentreras efter aktivering vid bindning till en ligand [24] . Om aktiveringen av receptorn sker i själva lipidflotten, skyddas signalkomplexet av flotten från externa enzymer , till exempel membranfosfataser . I allmänhet lockar lipidflottar proteiner till en ny mikromiljö så att deras (de)fosforylerade tillstånd kan förändras av lokala kinaser och fosfataser och ge upphov till efterföljande signalvägsreaktioner [25] . Det har fastställts att lipidflottar är involverade i många signalvägar, till exempel immunglobulin E signalvägen , T- och B- cellsantigenreceptorer , epidermal tillväxtfaktorreceptor (EGF), insulinreceptor , etc. Några exempel av sådana signalvägar ges nedan.
Studier av immunglobulin E (IgE) signalvägen har för första gången på ett övertygande sätt visat lipidflottars inblandning i signaltransduktion [26] [27] [28] . Bevis för lipidflottars deltagande i denna process är den minskade lösligheten av Fc-epsilon- receptorer (FcεR) i Triton X-100- tvättmedlet vid övergång från ett enda tillstånd till ett tvärbundet tillstånd med en annan receptor av samma typ [26 ] ; bildandet av kluster av gangliosider och GPI-förankrade proteiner som är tillräckligt stora för att vara synliga under ett fluorescensmikroskop [29] [30] ; terminering av vägen när ytkolesterol avlägsnas med metyl-β- cyklodextrin [31] etc.
Händelsesekvensen i denna signalväg är som följer. Först binder IgE till Fc-epsilon-receptorer som finns i plasmamembranen hos mastceller och basofiler genom deras Fc-segment. FcεR- tetrameren består av en α-, en β- och två γ-kedjor [28] . Först binder en FcεR-tetramer till en IgE-molekyl. α-kedjan binder till IgE, och de andra tre kedjorna innehåller immunreceptortyrosinbaserade aktiveringsmotiv ( ITAM) [ activation tyrosine motiv . Det oligomera antigenet binder sedan till flera IgE-molekyler som redan är bundna till FcεR vid den tiden, och syr ihop två eller flera receptorkomplex. Efter sådan koppling rekryteras det dubbelacetylerade icke-receptorn Src -liknande tyrosinkinaset Lyn för att fosforylera ITAM av de två receptorerna . Vidare binder tyrosinkinaset från Syk -familjen till ITAM-fosfotyrosinrester (resultatet av Lyns arbete) och startar signaleringskaskaden [26] [27] . Syk kan i sin tur aktivera andra proteiner som LAT. LAT-proteiner, genom att binda till varandra, kan rekrytera andra proteiner till flotten och dessutom förstärka (förstärka) signalen [32] .
T-cellsantigenreceptorn (TCR) är en molekyl som finns på ytan av T-lymfocyter (T-celler). Det inkluderar αβ- heterodimer , CD3-(γδε)-komplex och ξ-homodimer. α- och β -subenheterna innehåller extracellulära bindningsställen för peptider som presenteras på proteiner av klass I och II major histocompatibility complex (MHC) belägna på ytan av antigenpresenterande celler (APC). CD3- och ξ-subenheterna innehåller ITAM - cytoplasmatiska motiv . Vid signaltransduktion binder MHC-molekyler till TCR och kopplar samman två eller flera receptorer. Denna receptorbindning, som i IgE-signalvägen, rekryterar dubbelt acetylerade icke-receptor-Src-liknande tyrosinkinaser för att fosforylera ITAM-motiv. TCR rekryterar inte bara tyrosinkinaset Lyn, utan även Fyn [23] [33] . Därefter binder ZAP-70 -proteinet , som inte är involverat i IgE-signalvägen, till fosforylerade ITAMs, på grund av vilket det aktiveras själv och aktiverar LAT. Aktivering av LAT ger signalförstärkning. En annan skillnad mellan TCR-signalvägen och IgE-signalvägen är att TCR aktiverar Lck -proteinet , vilket kan leda till starkare flottkluster [34] [35] och därigenom förbättra signalen. En möjlig mekanism för nedreglering av denna väg kan vara bindningen av det cytosoliska kinaset Csk till det flottassocierade proteinet CBP . Efter det kan Csk undertrycka arbetet med Src-familjens kinaser genom fosforylering [36] .
B-cellsantigenreceptorn (BCR) är ett komplex av en membranbunden immunglobulin (mIg)-molekyl och en Iga-Igβ-heterodimer bestående av två polypeptider som är kopplade till varandra genom disulfidbindningar [37] . Både Igα och Igβ innehåller ITAM-motivet.
BCR-signalering liknar IgE- och TCR-signalering. Det anses allmänt att, förutom att verka genom BCR, kan lipidflottar vara involverade i många händelser som inträffar på ytan av en B-cell när den aktiveras. Funktionerna hos lipidflottar i B-celler inkluderar deras deltagande i BCR-signalvägen, modulering av signalvägarna genom co-receptorer , CD40 -signalvägar , endocytos av BCR-associerade peptidantigener och deras efterföljande laddning i tidiga endosomer (peptider bildade vid förstörelse av peptidantigenet av endosomenzymer, kommer senare att visas på cellytan i kombination med MHC II-molekyler och presenteras för T-celler) [37] .
För virus , obligatoriska intracellulära parasiter , för att komma in i en cell, är en specifik interaktion mellan viruset och cellulära receptorer på plasmamembranet nödvändig. Bevis ackumuleras att virus kommer in i cellen genom specifika membranmikrodomäner, inklusive lipidflottar.
De mest välstuderade exemplen på cellpenetration genom lipidflottar av icke-höljeförsedda virus är apvirus SV40 ( familjen Papovaviridae ) och typ I echovirus (EV1, familjen Picornaviridae ) [38] [39] .
SV40 använder två olika receptorer för att komma in i cellen: GM1 gangliosiden , som ligger i lipidflottar, och typ I MHC-molekylen [38] . Bindning av SV40 till MHC typ I-molekylen orsakar klustring och omfördelning av receptorer. SV40 kan attrahera fler kaveoler från cytoplasman och till och med få nya kaveoler att bildas vid inträdesplatsen. Signalkaskaden som utlöses av virusbindning till cellen leder till caveola-medierad viral endocytos inom 20 minuter. I vissa celltyper kan viruset komma in i kaveosomer (kaveoler som knoppar från membranet) direkt från obelagda vesiklar som knoppar från lipidflottar [39] [40] .
EV1 använder α2β1- integrinet som sin cellulära receptor . Många integrinheterodimerer kan binda till närliggande ställen på kapsiden av viruset. Som i fallet med SV40 utlöser bindning av viruset och dess bindning till cellen klustring och rörelse av integrinmolekyler från lipidflottar till kaveolliknande strukturer. När kolesterol avlägsnas från lipidflottar utvecklas inte ekovirusinfektion [38] [39] .
Det finns också virus som använder icke-kaveolär raft-medierad endocytos, såsom echovirus 11 (EV11, familj Picornaviridae ), men den detaljerade mekanismen för dessa processer har ännu inte studerats [39] .
Influensavirus binder till en cellulär receptor, sialinsyra , som är fäst vid ett glykokonjugat som initierar endocytos. Efter att viruset har överförts till sena endosomer, på grund av lågt pH , förändras konformationen av viral hemagglutinin (HA), varefter virusets lipidhölje smälter samman med endosommembranet och de virala frisätts i cytoplasma. Denna utmatning triggas av flödet av protoner genom den virala M2- protonkanalen , vilket kräver bindning till kolesterol för att fungera. Semliki forest virus (SFV, familj Togaviridae ) och Sindbis virus (SIN, familj Togaviridae ) använder kolesterol och sfingolipider för att komma in i cellen glykoproteinet som finns i deras skal , och efterföljande inträde i cytoplasman [41] . Humant T-lymfotropiskt virus typ I (HTLV-1, fam. Retroviridae ) kommer in i cellen via glukostransportör 1 ( GLUT1 ). Ebolavirus och Marburg-virus använder folatreceptorn -α (FRα) som en cellulär receptor , vilket är ett GPI-förankrat protein. Hepatit B-virus känner igen den humana komplementreceptorn typ 2 (CR2 eller CD21). Humant herpesvirus typ 6 (HHV-6) binder till CD46 -receptorn på cellytan. Alla dessa cellulära receptorer finns i lipidflottar eller flyttar dit under infektion .
Det sexuellt överförda humana immunbristviruset (HIV) måste övervinna barriären av epitelceller som inte uttrycker CD4 -receptorn eller kemokinreceptorer (dessa receptorer används ofta för att komma in i cellen) för att komma in i värden . En alternativ receptor för HIV-höljesglykoproteinet på epitelceller är glykosfingolipiden galaktosylceramid (GalCer), som är rikligt förekommande i lipidflottar [42] [43] .
En av anledningarna till de många kontroverser som har uppstått kring lipidflottar är svårigheten att studera dem i levande celler som inte är i termodynamisk jämvikt [21] . Lipidflottar är små mikrodomäner 10–200 nm stora [6] . Eftersom deras storlek ligger utanför ljusmikroskopets diffraktionsgräns är det extremt svårt att visualisera lipidflottar direkt. För närvarande studeras konstgjorda membran, men deras användning har många nackdelar. För det första är innehållet av proteiner i konstgjorda membran mycket mindre än i biologiska membran. För det andra är det svårt att modellera de interaktioner mellan membran och cytoskelett som äger rum i biomembran. För det tredje saknar konstgjorda membran naturlig asymmetri, och det är omöjligt att studera dem i ett icke-jämviktstillstånd [6] [44] .
En annan intensivt använd metod för att studera lipidflottar är fluorescensmikroskopi. Till exempel används fluoroforer associerade med B-subenheten av koleratoxin i stor utsträckning , som binder till den obligatoriska komponenten av flottar - gangliosid GM1. Lipofila membranfärgämnen används också , som antingen är inbäddade mellan flottarna och resten av membranet eller ändrar deras fluorescerande egenskaper beroende på membranets fas. Ett exempel på sådana färgämnen är den ofta använda laurdan . Flottar kan också märkas genom uttryck av fluorescensmärkta proteiner såsom Lck- GFP .
Kolesterolsekvestrering med filipin , nystatin och amfotericin B , avlägsnande med metyl-B-cyklodextrin, undertryckande av dess syntes med HGM-CoA-reduktashämmare är exempel på sådana metoder . De gör det möjligt att observera förändringar i signalering av signalsubstanser med en minskning av nivån av kolesterol i membranet [21] .
Med hjälp av högupplöst bildbehandling och matematisk modellering visades lipidflottproteiner sättas ihop till nanokluster med hög densitet med en radie på 5–20 nm. Genom att använda mätningen av fluorescensresonansenergiöverföring ( eng. fluorescensresonansenergiöverföring, FRET ) mellan samma prover (homo-FRET eller fluorescensanisotropi ) , drog Sharma och kollegor slutsatsen att en bråkdel (20-40%) av GPI- förankrade proteiner är organiserade i högdensitetskluster med en radie på 4-5 nm [45] . För närvarande, för att övervinna problemet med den lilla storleken och den dynamiska naturen hos lipidflottar, används alltmer observation av rörelsen av enskilda partiklar och molekyler med hjälp av kylda, känsliga CCD- kameror och total intern reflektionsmikroskopi (TIRF). Denna teknik gör det möjligt att få information om partiklars förmåga att diffundera i membranet som studeras, samt att identifiera zoner med begränsade diffusions- och diffusionsbarriärer på detta membran [46] .
Andra optiska tekniker används också. Till exempel kan fluorescenskorrelation och korskorrelationsspektroskopi FCS/FCCS) användas för att få information om rörligheten hos en fluorofor i ett membran . FRET -tekniken ( Fluorescence Resonance Energy Transfer ) kan avgöra när fluoroforer är i närheten, och tekniker som använder optisk pincett kan ge information om membranviskositet [21] .
Atomkraftsmikroskopi , scanning jonledande mikroskopi ( Eng. Scanning Ion Conductance Microscopy (SICM) ), bipolarisationsinterferometri , kärnmagnetisk resonans används också för att studera lipidflottar ; dock är fluorescensmikroskopi fortfarande den dominerande tekniken för att studera lipidflottar. Förhoppningen är att superupplösningsmikroskopi (t.ex. STED-mikroskopi [47] ) och olika former av strukturerad belysningsmikroskopi i framtiden kommer att hjälpa till att övervinna de problem som orsakas av diffraktionsbegränsning .
Dessutom används enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA), Western blotting och fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) [48] [49] [3] för att arbeta med flottar .
Flottars roll i intracellulär signalering, metabolism och underhåll av cellstruktur är ännu inte helt definierad, trots många experiment med olika metoder, och till och med själva existensen av lipidflottar ifrågasätts [50] .
Följande argument argumenterar mot förekomsten av lipidflottar:
Den första vederläggningen av den sista punkten är att flottens Lo-fas är tätare på grund av intermolekylära vätebindningar mellan sfingolipid- och kolesterolmolekyler, och dessa bindningar bildas inte någon annanstans [51] .
Det andra argumentet mot förekomsten av lipidflottar beror på effektiviteten i att förstöra lipidflottar i forskning. Avlägsnande av kolesterol från flottar kan ha negativa konsekvenser för tillförlitligheten av ytterligare resultat på flottarnas funktioner [52] . De flesta forskare använde hårda metoder för att avlägsna kolesterol från membran, vilket förstörde inte bara flottar, utan också en annan membranfosfolipid , fosfatidylinositol -4,5-bisfosfat (PI(4,5)P 2 ). Denna fosfolipid spelar en viktig roll i regleringen av cytoskelettet [53] , och dess förstörelse kan leda till de resultat som vanligtvis förklaras av avlägsnandet av kolesterol, inklusive lateral diffusion av proteiner i membranet [54] . Eftersom de vanligaste metoderna förstör både flottar och PI(4,5)P 2 kan effekten av kolesterolavlägsnande på en viss process inte enbart tillskrivas flottförstöring, eftersom många processer som inte är flottar kan påverkas. Slutligen, även om det nu antas att flottar på något sätt är fästa vid proteiner, tror vissa forskare att proteiner kan rekryteras in i flotten endast genom interaktion med lipidacylsvansar som är gömda inuti membranet, och inte på annat sätt [55] .
| Cellmembranstrukturer _ | |
|---|---|
| Membranlipider | |
| Membranproteiner |
|
| Övrig |
|