DNA- vaccin (även genvaccin , nukleinsyravaccin ) är en genetiskt modifierad konstruktion som, efter att ha introducerats i en cell , säkerställer produktionen av patogena proteiner eller tumörantigener och orsakar ett immunsvar . Införandet av DNA-vacciner i kroppen kallas genetisk immunisering. DNA-vaccination har flera fördelar jämfört med konventionella vacciner. I synnerhet har det visats att sådana vacciner inte bara ger produktion av antikroppar ( humoral immunitet ), utan också ett specifikt cytotoxiskt svar ( cellulär immunitet ).), vilket tidigare endast var möjligt med levande vacciner . Idag används inte DNA-vacciner för att behandla människor, men genetisk immunisering förutspås hjälpa till att övervinna en rad sjukdomar.
Idén att använda DNA- fragment för vaccination dök upp på 1950- och 1960 -talen . Efter en rad experiment fann man att den genetiska informationen i DNA behåller förmågan att transkriberas och översättas efter att ha överförts till en annan cell [1] [2] . Samma år fann man att införandet av genomet av polioviruset i djur stimulerar produktionen av antikroppar [3] [4] . Senare visades aktivering av humoral immunitet för DNA-molekyler härledda från icke-infektiösa medel [5] . Sedan 90-talet har vetenskapliga laboratorier börjat utforska de immunstimulerande egenskaperna hos DNA . 1992 visade Tang och hans kollegor att den mänskliga tillväxthormongenen inbäddad i en plasmid uttrycks stabilt i möss , och det syntetiserade hormonet känns igen av immunsystemet som ett antigen och stimulerar produktionen av antikroppar. Processen att introducera plasmid-DNA för att stimulera humoral immunitet kallades "genetisk immunisering" av Tang [6] . Men året därpå konstaterade en annan grupp forskare att introduktionen av en plasmid som kodar för proteiner från influensaviruset orsakar både ett humoralt och ett cellulärt svar [7] . Induktion av båda grenarna av immunitet under samma år hittades också för en plasmid som innehåller HIV-gener [8] . Sedan 1995 har det börjat dyka upp bevis för att DNA-vaccination kan aktivera immunförsvaret mot cancer [9] [10] . För cirka 20 år sedan ägde de första kliniska prövningarna av DNA-vaccin rum, som först och främst skulle visa på säkerheten med den nya metoden. Patienterna injicerades med gener för HIV, influensavirus, herpes, hepatit B, det orsakande ämnet för malaria. Resultaten av alla tester var ganska uppmuntrande: DNA-vacciner uttrycktes stabilt, framkallade ett immunsvar och orsakade inga allvarliga biverkningar, vilket blev drivkraften för deras fortsatta forskning [11] .
Strukturellt sett är ett DNA-vaccin en nukleotidsekvens inbäddad i en vektor som kodar för ett eller flera specifika antigener . Inom genteknik är en vektor en nukleinsyramolekyl som tjänar till att leverera genetiskt material till celler och säkerställer dess replikation eller uttryck . Tidigare användes vektorer baserade på virus för att transportera gener in i cellen: ett modifierat (försvagat) variolavirus , adenovirus och retrovirus . Virala vektorer är ganska effektiva, men de har en betydande sannolikhet för biverkningar associerade med den relativt höga immunogeniciteten hos själva vektorn. Därför används idag oftast en bakterieplasmid som vektor - en liten stabil cirkulär DNA-molekyl som kan replikeras autonomt. I sig själv orsakar inte plasmiden det önskade specifika immunsvaret ; för detta sys generna av immunogena proteiner in i den. Dessutom måste DNA-vaccinet innehålla de regulatoriska sekvenser som är nödvändiga för genuttryck i eukaryota celler . Den färdiga DNA-konstruktionen levereras till bakteriecellen, där antalet kopior ökar. Detta följs av isolering och rening av plasmider som bär den önskade insättningen [12] .
Ett viktigt steg i skapandet av DNA-vacciner är designen (konstruktionen) av en vektor. Erforderliga strukturer för en plasmidvektor är restriktionsställen , en selekterbar markör och ett ursprung för replikation av ett DNA-vaccin i en bakteriecell . För att antigensyntes ska kunna äga rum måste ett DNA-vaccin innehålla en promotor och en polyadenyleringssignal. Promotorn är en viktig faktor för vaccinets effektivitet, eftersom den bestämmer styrkan på immunsvaret : ju mer uttryck av genen som kodar för virus- eller tumörantigenet , desto starkare immunsvar. Den mest använda promotorn är SV40-viruset eller cytomegaloviruset (CMV). För att stabilisera mRNA- transkripten infogas en polyadenyleringssignal, oftast härledd från genen för bovint tillväxthormon (BGH) eller SV40-viruset , i plasmiden . Bakteriella antibiotikaresistensgener väljs som selektiva markörer ; ofta är detta en kanamycinresistensgen. När man designar DNA-vacciner, den mest populära ursprungspunkten för Escherichia coli- replikation [13] .
Vektorn är en viktig komponent i DNA-vaccinet, men dess immunogenicitet bestäms exakt av insättningen, den DNA-sekvens som kodar för antigenet. Bland virala antigener är fusionsproteiner bäst lämpade för immunisering; dessa är relativt konserverade proteiner som tillåter viruset att komma in i cellen. För vaccination mot grampositiva bakterier är det tillrådligt att infoga generna från de bakterieproteiner som bestämmer sjukdomens patogenes i plasmidvektorn. Bland proteinerna från gramnegativa bakterier har poriner en hög immunogenicitet [14] . För terapeutiska antitumör-DNA-vacciner används cancercellsmarkörproteiner [15] .
Det färdiga vaccinet måste levereras till människo- eller djurkroppen, där dess destination är antigenpresenterande celler (APC) - makrofager , dendritiska celler , B-lymfocyter . Här kommer syntesen och posttranslationell modifiering av antigenet att ske, varefter det kommer att infogas i cellmembranet för att fånga immunsystemets uppmärksamhet . Huvudproblemet är att leverera en tillräcklig mängd plasmid till APC:n. Metoder för att leverera genetiskt material till en cell delas vanligtvis in i 2 grupper: viral och icke-viral. Eftersom virala vektorer har ett antal betydande nackdelar, presenterar detta avsnitt endast icke-virala metoder för att leverera DNA-vacciner.
Med adenovirus
Som en del av lipoplexet
I början av 1990 -talet var intramuskulära mikroinjektioner det vanligaste sättet att introducera DNA i en cell, på grund av metodens enkelhet. För att göra detta löses DNA i vatten eller isotonisk lösning , vid behov tillsätts ett adjuvans (ett ämne som förstärker immunsvaret ). Sedan, med hjälp av ett tunt glasrör, injiceras lösningen i muskelvävnaden , där rollen som APC utförs av dendritiska celler . Väl i kärnan av dendritiska cellen börjar vaccinet att uttryckas och syntesen av proteiner - antigener sker . Med hjälp av mikroinjektioner kan DNA även injiceras subkutant, i bräss , lever , tumörvävnad [16] , men det är i muskelvävnaden som det längsta (upp till ett år) uttrycket av DNA-vaccinet observeras [ 17] .
På grund av den höga koncentrationen av Langerhans-celler (en subtyp av dendritiska celler) är huden ett attraktivt mål för DNA-vaccination [18] . För intradermal (subkutan) administrering används en rad mikronålar , vars längd är flera hundra mikrometer. Det finns olika alternativ för intradermal vaccination. Det enklaste innebär att man lossar stratum corneum med en rad mikronålar (hudens yttre lager, vanligtvis 10-20 µm) för att öka dess permeabilitet för ytterligare lokal injektion av en DNA-lösning. Mer effektivt är användningen av mikronålar belagda med ett torrt vaccin, som löses upp redan under huden [19] .
Effektiviteten av denna metod är vanligtvis låg, eftersom DNA först kommer in i det intercellulära utrymmet och först därefter ingår i cellerna .
Elektroporation är ett traditionellt tillvägagångssätt för DNA-leverans till bakterieceller och cellkulturer , som bygger på applicering av en elektrisk impuls . En sådan impuls skapar porer i cellmembranet, vilket underlättar inträdet av negativt laddat DNA. Denna metod har antagits för leverans av DNA-vacciner till djur och människor och kan avsevärt öka effektiviteten hos en konventionell injektion. Anordningen för elektroporering har en källa för elektrisk ström och ett engångsgaller, som består av en spruta och nålelektroder. Sprutan injicerar vaccinet i muskelvävnaden och elektroderna skapar ett elektriskt fält som underlättar införandet av DNA i myocyter och dendritiska celler . Hittills har anordningar utvecklats som kan öka effektiviteten av vaccination med 1000 gånger jämfört med en konventionell injektion. Elektroporation kan användas för både intramuskulär och subkutan administrering av DNA-vaccinet. Nackdelarna är lätt smärta vid injektionsstället, behovet av specialiserade apparater [18] . Istället för ett elektriskt fält kan ett magnetfält användas . Sådana enheter fungerar på samma princip, men i detta fall är proceduren helt smärtfri och mindre skadlig för celler [20] .
Det elektriska fältets verkan ökar inte bara absorptionen av DNA-vaccinet av celler, utan stimulerar också utvecklingen av ett immunsvar. Användningen av elektroporering leder till mindre vävnadsskador - en lokal inflammatorisk process utvecklas. Skadade celler frisätter kemokiner , så makrofager , lymfocyter och dendritiska celler skickas till dem . Att öka koncentrationen av immunceller på injektionsstället ökar vaccinets effektivitet [21] .
Sonoporation är en metod för att överföra främmande DNA till celler med hjälp av ultraljud . Ultraljud ökar permeabiliteten i cellmembranet, vilket gör att exogent DNA lättare tränger in i cellen. För första gången tillämpades sonoporation för genöverföring till en cell 1986 [22] . Denna metod används för att introducera DNA-molekyler i cellerna i hornhinnan , hjärnan , benvävnaden , njurarna , bukspottkörteln , embryonal vävnad, skelett- och hjärtmusklerna . Jämfört med andra metoder är sonoporation lite studerat, mycket mer ansträngning krävs för att förbättra dess effektivitet, särskilt på nivån för hela organismen [16] .
Ballistisk transfektion är baserad på beskjutning (bombning) av organ och vävnader med mikropartiklar av tungmetaller ( guld , volfram ) med en diameter på 1-3 mikron, täckta med DNA- molekyler . DNA-vaccinet som administreras på detta sätt uttrycks i målceller och deras produkter kommer in i blodomloppet. För att accelerera partiklarna används en anordning som liknar handeldvapen - genpistolen eller genpistolen . Mikropartiklarna passerar genom cellmembran och bär den genetiska konstruktionen direkt in i cellkärnan . Inträngningsdjupet för mikropartiklar är som regel litet - upp till 1 mm, så metoden används huvudsakligen för transfektion av huden eller intilliggande broskvävnad . Speciella skalningsförhållanden tillåter mikropartiklar att penetrera till ett djup av 4-5 mm och överföra genkonstruktioner till tvärstrimmiga muskelfibrer . Vanligtvis dör celler som ligger direkt i mitten av skottet, medan de mest framgångsrika protransformerade cellerna är belägna i zonen 0,6-1 cm från mitten. Denna teknik kallas även bioballistics eller biolistics [23] .
Den första genpistolen skapades av en grupp forskare mellan 1983 och 1986 i syfte att transformera växtceller. Det var en pistol utvecklad från en automatisk spikpistol. DNA med en reporter (markör) gen applicerades på en volframboll och brändes in i en petriskål . Uttryck av reportergenen indikerade effektiviteten av immunisering. Idag används partiklar av guld eller silver för DNA-leverans , eftersom de inte är giftiga för cellen, till skillnad från volfram [24] .
1999 utvecklades injektionsanordningar som kan administrera ett DNA-vaccin utan användning av nål [25] . Sådana enheter fungerar tack vare Lorentz-kraften : en liten kraftfull magnet skapar ett betydande tryck, aktiverar en kolv som skjuter ut läkemedlet med ljudets hastighet [16] . Genom att ändra strömstyrkan kan du välja djupet på injektionen och dosera läkemedlen. Proceduren är helt smärtfri och har tidigare använts för att administrera insulin till diabetespatienter och vid storskaliga vaccinationer . En betydande nackdel med denna metod är att högt tryck teoretiskt kan förändra strukturen hos de introducerade molekylerna [26] . Denna injektionsteknik fortsätter dock att förbättras, och idag har enheter utvecklats som kan leverera DNA till ett djup på upp till 16 mm [27] .
Levande bakteriella vektorer är stammar av Salmonella , Shigella eller Listeria som bär mutationer i biosyntes eller invasionsgener som eliminerar deras patogenicitet och förmåga att överleva i värden eller miljön. Istället sätts de önskade immunogena proteingenerna in i bakteriegenomet. Den försvagade bakterien förs in i kroppen oralt (genom munnen , genom att svälja) eller intranasalt (genom injektion i näsöppningen ), så denna vaccinationsmetod kräver ingen utrustning. Dessutom stimulerar sådan administrering ett mukosalt immunsvar , vilket är viktigt eftersom de flesta patogener kommer in i kroppen genom munnen och näsöppningarna. Förbi magsäcken kommer den försvagade bakterien in i tunntarmen . Vidare tränger bakterien in i Peyers fläckar - intestinala lymfkörtlar . Väl i mitten av Peyers plåster blir bakterierna ett mål för makrofager och genomgår fagocytos . I makrofagernas cytoplasma frisätter bakterien DNA-vaccinet, varefter DNA:t kommer in i kärnan, och bakterien oskadliggörs av immunsystemet [18] [28] .
Liposom - en sfärisk formation (ca 100 nm i diameter), bestående av ett dubbelt lipidskikt . Liposomer har en hålighet inuti, som vanligtvis är fylld med ett lösningsmedel, men kan användas för att leverera en mängd olika ämnen, inklusive DNA-vacciner. Deras hydrofoba skal tillåter dem att smälta samman med cellmembran och transportera deras innehåll in i cellen. Användningen av liposomer började 1965, och detta blev en kraftfull motor för utvecklingen av bionanoteknik [29] .
En lovande metod för direkt introduktion av en DNA-konstruktion i målceller är leveransen av en genetisk konstruktion som en del av katjoniska liposomer byggda av positivt laddade lipider. Katjoniska liposomer med en negativt laddad DNA-molekyl bildar ett DNA-lipidkomplex - lipoplex. Fördelarna med att använda sådana komplex är förmågan att bära en stor mängd information, icke-smittsamhet, dessutom är de enkla och billiga att tillverka [30] . År 2003 skapades extremt små, millimikronstora liposomer belagda med polyetylenglykolpolymer som kan bära terapeutiskt DNA genom blod-hjärnbarriären och leverera det till hjärnans neuroner , vilket tidigare var omöjligt [31] .
Polyplex, system som består av positivt laddade polymerer ( polykatjoner ) och negativt laddade DNA-molekyler, används för att introducera stora DNA-konstruktioner (>10 kb ) i cellen. Storleken på sådana komplex är mindre än 100 nm, vilket å ena sidan inte tillåter dem att smältas av makrofager (eftersom de reagerar på partiklar större än 200 nm), och å andra sidan är de tillräckligt stora inte som ska filtreras i njurarna [32] .
Polykatjoner kondenserar DNA-molekylen till komplex och säkerställer på så sätt dess stabilitet och skydd mot inverkan av nukleaser . Katjoniska proteiner, syntetiska aminosyrahomopolymerer ( polylysiner , polyargininer), kitosanpolysackarid , polyetylenamin kan fungera som DNA-bindande polymerer . Vanligtvis är polykatjonen närvarande i överskott i kompositionen av polyplexer, som ett resultat av vilket detta komplex är lösligt och positivt laddat. Om en ligand för en specifik cellreceptor sys till polyplexet , kan DNA-vaccinet riktas mot en specifik celltyp. Processen för leverans av genetiskt material i kompositionen av polyplexer inkluderar två steg: extracellulär (väg från injektionsstället till målceller) och intracellulär (interaktion med målceller, endocytos , utgång från endosomer , leverans till kärnan). Den första barriären som komplexet behöver övervinna är blodet och den extracellulära matrisen . Därför väljs sådana fysikalisk-kemiska parametrar för polyplexet för att öka dess stabilitet, för att undvika oönskade interaktioner med blodproteiner och immunsvaret orsakat av polykatjonens kemiska natur. Väl i målcellerna adsorberas polyplexet på plasmamembranet , absorberas av endocytos, varefter det måste lämna endosomen och dissocieras till en katjonisk polymer och en DNA- molekyl . Fritt DNA skickas till kärnan och den katjoniska polymeren lämnar cellen och utsöndras från kroppen [33] .
| Egenskaper för de vanligaste leveransmetoderna för DNA-vacciner [16] [18] | ||
| Metod | Fördelar | Brister |
| Intramuskulära eller subkutana injektioner |
|
|
| elektroporering |
|
|
| genpistol |
|
|
| Introduktion på grund av högt tryck |
|
|
| Förpackning i liposomer |
|
|
Antigenet som syntetiseras i cellen är mottagligt för bearbetning , varefter det presenteras för immunkompetenta celler. Bearbetning är uppdelningen av ett antigent protein i immunogena peptidfragment. Presentation betyder presentation av ett antigenfragment kopplat med molekyler av det huvudsakliga histokompatibilitetskomplexet (MHC) till immunkompetenta celler. Det finns två mest signifikanta klasser av dessa molekyler: MHC klass I (MCG-I) och MHC klass II (MCG-II). För att binda till molekyler av varje klass bereds antigenet i specialiserade fack i cellen. Endogena antigenproteiner riktas till proteasomen för nedbrytning, varefter de presenteras i komplex med MHC-I på cellytan. Här, när de träffas, känns de igen av CD8+ T-celler ( T-dödare ), som implementerar ett cytotoxiskt immunsvar . Exogena proteiner klyvs av lysosomala proteaser, inkorporeras i MHC-II och känns igen av CD4+ T-cell ( T-hjälpar ) receptorer. De senare orsakar både cellulära och humorala svar.
| Antigenbearbetningsvägar och immunsvarsformer | ||||
| Antigen lokalisering | Huvudverktyg för bearbetning | Antigenpresenterande komplex | Celler som känner igen antigen-MHC-komplexet |
immunsvar |
|---|---|---|---|---|
| I en bur | Proteasom | GKG-I | T-mördare | Cytotoxisk |
| Ut ur buren | Lysosom | GKG-II | T-hjälpare | Cellulär, humoristisk |
DNA-vaccination involverar endogen antigensyntes , så denna väg är dominerande. Antigenbearbetning längs MHC-I-vägen sker i flera steg. Proteinet som syntetiseras i kärnan transporteras till cytoplasman , klyvs av proteasomen till korta peptider - epitoper, som överförs till det endoplasmatiska retikulumet (ER) av speciella antigentransporterproteiner ( TAP, transportör associerad med antigenbearbetning ) . I EPR är varje epitop kopplad till MHC-I-molekylen, varefter det bildade komplexet skickas till Golgi-apparaten för glykosylering . Därifrån skickas komplexet i vesikelns sammansättning till plasmamembranet . Efter fusionen av vesikeln med plasmalemma uppträder komplexet på cellytan, där det känns igen av T-mördarreceptorer, som har cytotoxisk aktivitet [34] .
Den huvudsakliga källan till peptider som binder till MHC-II är exogena proteiner som har kommit in i cellen via endocytos . Det har dock visats att vissa intracellulära proteiner också kan presenteras i komplex med MHC-II [35] . Samtidigt överförs nysyntetiserade proteiner, efter att ha kommit in i cytoplasman, till lysosomer , där antigenet klyvs under verkan av sura proteaser . Därefter smälter lysosomen, som innehåller epitoperna , samman med vesikeln , som bär MHC-II-molekylen. Inuti den förenade vesikeln bildas ett epitop-MHC-II-komplex, som efter fusionen av vesikeln med plasmalemma förs till cellytan. Här känns detta komplex igen av T-hjälparreceptorer , vilket resulterar i deras aktivering. Detta leder till stimulering av både cellulär (aktivering av T-dödare ) och humoral immunitet (aktivering av B-lymfocyter ).
Traditionell vaccination med lösliga proteinantigener syftar till mobilisering av T-hjälpare. Det relativt låga T-hjälparsvaret är en av nackdelarna med DNA-vacciner. Den nuvarande generationen av DNA-vacciner är inte heller kapabel att inducera produktionen av höga antikroppstitrar . För att öka T-hjälparaktiveringen måste antigenet omdirigeras till MHC-II-vägen. För att göra detta byggs en signal om lysosomal lokalisering in i DNA-vaccinet: det syntetiserade antigenet kommer att styras till lysosomer, vilket innebär att det kommer in i vägen för MHC-II [34] .
Huvudfrågan om framtiden för DNA-vacciner handlar om hur man kan öka deras effektivitet. Hittills genomförs ett stort antal studier om optimering av de utvecklade DNA-vaccinerna. Sökandet efter en lösning utförs i två riktningar: öka uttrycket av vaccinet och öka immunogeniciteten hos det kodade antigenet.
En viktig komponent i DNA-vaccinet är promotorn . Bakteriepromotorer är inte lämpliga för uttryck av antigenet i däggdjursceller , så promotorerna för onkogena virus har använts istället. Nu, för att förbättra säkerheten för vacciner, har de ersatts med promotorer från icke-cancerframkallande föremål, såsom humant cytomegalovirus (CMV). För de flesta DNA-vacciner är denna promotor det optimala valet: den är starkt uttryckt i ett brett spektrum av celler. För genuttryck i specifika vävnader är det lovande att använda promotorer specifika för denna typ av vävnad. Till exempel resulterar användningen av en muskelkreatinkinaspromotor när den administreras intramuskulärt i en tiofaldig ökning av antikroppssyntes och induktion av ett T-cellssvar än användningen av ett liknande DNA-vaccin med en CMV-promotor . Promotorn för desmin -genen , som kodar för ett av cytoskelettproteinerna , visade också hög effektivitet i myocyter . För att öka uttrycket av DNA-vaccinet i keratinocyter ( epitelvävnadsceller ) används promotorer av metallothionein -genen (ett protein som binder tungmetaller ) eller vitamin D3 -hydroxylasgenen [13] [36] .
Nivån av transkriptionsinitiering ökas vanligtvis genom användning av en stark promotor och förstärkare , och termineringsegenskaper kan bli en begränsande faktor. Effektiviteten av polyadenylering och bearbetning av det primära RNA-transkriptet varierar beroende på sekvensen av polyA-signalen . Det vill säga, polyadenyleringssekvensen påverkar antigensyntesen. Till exempel är den allmänt använda polyA-signalen från SV40-viruset mindre effektiv än polyadenyleringssignalen från kanin -β-globingenen eller bovint tillväxthormongenen [13] .
För effektiv translation måste däggdjurs- mRNA ha den så kallade Kozak-sekvensen . Att infoga denna sekvens i en DNA-konstruktion kan avsevärt öka nivån av antigensyntes. För att RNA-polymeras inte ska hoppa över genens stoppkodon och förhindra syntesen av ett förlängt protein som sedan inte kan vikas korrekt, kan genen avslutas med ett dubbelt stoppkodon [36] .
När de designar ett DNA-vaccin försöker de också optimera dess kodoner . Optimeringsproceduren innebär att gränserna i gensekvensen ändras på ett sådant sätt att proteinets aminosyrasekvens inte förändras, men effektiviteten av translationen av dess mRNA ökar. Anledningen är att de flesta aminosyror kodas av mer än ett kodon. Varje kodon har sitt eget tRNA , och representationen av olika tRNA i cellen är inte densamma, och den varierar också beroende på typen av organism. Kodon väljs på ett sådant sätt att närvaron av önskat tRNA under antigensyntes inte blir en begränsande faktor [13] [37] .
Även om styrkan på immunsvaret korrelerar med uttrycksnivån för DNA-vaccinet, finns det en viss platå för varje antigen, varefter en ökning av mängden antigent protein inte kommer att öka antikroppsproduktionen. Samtidigt kan ett starkare immunsvar uppnås genom att optimera antigenet [38] . Till exempel genom att kombinera ett antigen med en ligand till en specifik antigenpresenterande cell (APC) -receptor . En sådan ligand kan vara CD40-markörproteinet, den extracellulära domänen av Fms-liknande tyrosinkinas-3, eller T- mördarantigen-4 [39] . På grund av interaktionen av ligand-receptorn ökar effektiviteten för att fånga det antigena proteinet i APC.
Att underlätta nedbrytning av antigenet i proteasomen eller lysosomen kommer också att stimulera ett immunsvar. För att förbättra den proteliotiska klyvningen av antigenet infogas en ubiquitinationssignal i dess sekvens [34] . Användningen av DNA-kodande vacciner istället för hela antigenet, flera epitoper av olika ursprung, kan avsevärt utöka spektrumet av immunsvaret [38] .
För antitumör-DNA-vacciner är kombinationen "tumörantigen + viralt eller bakteriellt antigen" effektiv. Till exempel ökar kombinationen av ett tumörantigen med en tetanustoxinepitop signifikant aktiveringen av mördar-T-celler mot cancerceller [40] [41] .
När traditionella vacciner används, tillsätts adjuvans till dem för att öka immunsvaret . DNA-vaccinet är av bakteriellt ursprung, så det är i sig ett immunstimulerande medel . För att förstärka immunsvaret sätts adjuvansgener in i DNA-vaccinet eller så används en ytterligare plasmid som kodar för immunstimulerande proteiner [42] .
Immunstimulerande effekt av bakteriella CpG-dinukleotiderFunktionen hos en plasmid är inte begränsad till att leverera gener till celler. Redan 1893 fann man att en blandning av bakteriella lysat minskar utvecklingen av cancertumörer, men först 1983 konstaterades att lysatets immunstimulerande egenskaper beror på bakteriella DNA-molekyler [43] . 1995 visades det att immunstimulering orsakas av CpG-motiv i bakteriellt DNA [44] . I bakterier, såväl som DNA-virus, är dessa motiv ometylerade . Hos människor och högre primater , tvärtom, innehåller cytosin i de flesta CpG-dinukleotider en metylgrupp . Därför uppfattas ometylerade CpG-motiv av människokroppen som patogenassocierade molekylära mönster ( PAMPs ). PAMP-föreningar känns igen av tollliknande receptorer , som, beroende på typen av ligand, är uppdelade i flera typer. Ometylerade CpG-motiv känns igen av TLR-9- receptorn som finns på membranen i det endoplasmatiska retikulumet hos B-lymfocyter , dendritiska celler och naturliga mördarceller . Bindning av receptorn till ometylerade CpG-motiv utlöser en kaskad av reaktioner som inducerar syntesen av pro-inflammatoriska cytokiner - interferon-1 och IL-12 [45] .
Uttryck av cytokiner och andra immunmodulatorerFör DNA-vaccination används oftast cytokingener som adjuvans. Cytokiner är en klass av proteinmolekyler som reglerar intercellulära och intersysteminteraktioner i kroppen, i synnerhet immunsystemets funktion . Alla cytokiner, och fler än 30 är kända, kan modulera immunsvaret . Cytokiner IL2, IL-12, interferon y, IL-15, IL-18 och IL-23 har en stimulerande effekt på T-hjälpare av första klass. Cytokiner som modulerar verkan av klass II T-hjälpare inkluderar: IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 och IL-13. Typen av cytokin väljs efter vilken typ av immunsvar man vill förstärka [46] .
| Skillnader i immunsvaret hos T-hjälpare klass 1 och 2 | ||
| Skillnader | T-hjälpare 1 | T-hjälpare 2 |
|---|---|---|
| Master Cell Partner | Makrofagen | B-cell |
| immunsvar | Cellulär . Förbättrar verkan av makrofager |
Humoraliskt .
Stimulerar B-cellsproliferation |
Det är möjligt att uppnå en ökning av immunsvaret med hjälp av kemokiner. Kemokiner är en familj av cytokiner som kan orsaka kemotaxi hos känsliga celler, inklusive immunceller. I synnerhet finns kemokinreceptorer på antigenpresenterande kemokinceller . Bindning av en kemokin till dess receptor leder till endocytos av antigen-kemokinkomplexet inuti APC. Denna strategi används effektivt både i utvecklingen av antivirala DNA-vacciner [47] och antitumörvacciner [ 48] .
Adjuvansfunktionen kan också utföras av HSP70-proteinet ( värme -chockproteiner, HSP ) . Den immunstimulerande effekten av HSP70 är baserad på dess förmåga att komma in i det extracellulära utrymmet och binda till APC-receptorer. Mekanismen för HSP70-transport till utsidan har ännu inte klarlagts helt, men troligtvis finns det flera sätt - exocytos , utsöndring till utsidan eller utgång genom kanalen [49] . Bindning av HSP70 till dess receptor resulterar i dendritisk cellaktivering , medierar antigenpresentation och stimulerar kemokinproduktion. Eftersom antigenet är fuserat till HSP70 kommer det också in i det extracellulära utrymmet, så det kan presenteras via MHC-II-vägen och aktivera B-celler . För att undvika autoimmuna reaktioner använder DNA-vacciner bakteriegenen HSP70 [50] .
DNA-vaccinationsmetoden har ett antal fördelar, varav den viktigaste är att utlösa både humorala och cellulära immunsvar . DNA-baserade vacciner ger långvarigt antigenuttryck och följaktligen ett stabilt immunsvar. Ytterligare faktorer som bidrar till utvecklingen av DNA-immunisering inkluderar enkelheten och låg kostnad för vaccinproduktion [51] .
| Fördelar | Brister |
|---|---|
|
|
Alla fyra vacciner som godkänts av US Food and Drug Administration är baserade på plasmider . För tre av dem rekommenderade tillverkaren administreringsmetoden - intramuskulärt, för LifeTide-vaccinet - intramuskulär injektion i kombination med elektroporering . Om resten av vaccinerna syftar till att aktivera immunförsvaret, så är den immunstimulerande effekten för LifeTide-vaccinet ytterligare. Produkten av vaccinet är somatoliberin , ett hormon som stimulerar frisättningen av tillväxthormon och prolaktin i hypofysen . Verkan av de två sista hormonerna hos grisar leder till en ökning av djurmassan och en ökning av antalet kullar [52] . Samtidigt stimulerar införandet av en plasmid som kodar för somatoliberin i djur produktionen av T-lymfocyter , naturliga mördare [53] och ökar därför kroppens immunmotstånd.
| Vaccinets varumärke | Licensår | Mål | Djur | Vaccinprodukt | Syftet med vaccinet |
|---|---|---|---|---|---|
| West Nile Innovator ( USA ) Arkiverad 4 oktober 2013 på Wayback Machine | 2005 | West Nile virus | Hästar | Strukturellt protein av PreM-E-viruset | Skydd mot viruset |
| "Apex-i-h-en" ( Kanada ) Arkiverad 4 oktober 2013 på Wayback Machine | 2005 | Det orsakande medlet för infektiös nekros av hematopoetisk vävnad (IGT) | Lax familjens fisk | Viralt glykoprotein | Öka kvantiteten och kvaliteten på fiskmat |
| LifeTide S-Double 5 ( Australien ) Arkiverad 9 december 2012 på Wayback Machine | 2008 | Ett tillväxthormon | Grisar och andra boskap | Grissomatoliberin _ | Ökat strö hos suggor; minskar markant perinatal mortalitet och sjuklighet |
| "ONSEPT" ( USA ) | 2010 | Melanom | Hundar | Mänskligt tyrosinas | Som ett alternativ till strålbehandling och kirurgi vid behandling av melanom |
Medan induktionen av cellulära och humorala immunsvar har påvisats på ett övertygande sätt för främmande antigener associerade med infektionssjukdomar, har användningen av DNA-vacciner för behandling av cancer hittills varit mindre framgångsrik. Induktion av effektiv antitumörimmunitet är en svår uppgift. Kliniska studier har bekräftat den allmänna säkerheten och låga toxiciteten hos antitumör-DNA-vacciner, men effektiviteten av immunsvaret de framkallade visade sig vara svagt, och antitumöraktiviteten, i vissa fall, var generellt tveksam [39] .
Under de senaste trettio åren har sju vacciner kommersialiserats för att förhindra hepatit B-infektion. De är alla beroende av användningen av ett av de virala höljesproteinerna som kallas ytantigenet eller HBsAg .
Vaccinet består av tre injektioner av vaccinet för att skapa en tillräckligt uttalad immunförändring, där den andra injektionen ges en månad efter den första dosen och den tredje injektionen sex månader efter den första dosen [55] Efter vaccination kan hepatit B-ytantigen detekteras i blodserumet i upp till flera dagar; detta kallas vaccinantigenemi. Därefter uppstår antikroppar från immunsystemet mot HBsAg i blodomloppet . Dessa antikroppar är kända som anti-HBsAg . Sedan dess ger dessa antikroppar och immunsystemets minne immunitet mot infektion med hepatit B. [56]
DNA-vaccin mot COVID-19INO-4800 DNA-vaccinet tillverkat av Inovio Pharmaceuticals genomgår för närvarande kliniska fas I-II prövningar [57] [58] . Anti-covid DNA-vaccin AG0301-COVID19, ZyCoV-D, GX-19, CORVax, såväl som DNA-vacciner tillverkade av Symvivo och Entos Pharmaceuticals genomgår också kliniska prövningar .
DNA-vaccin mot kariesOrsaken till karies är en lokal förändring av pH på grund av jäsning ( glykolys ) av kolhydrater som utförs av bakterier [59] . Forskare från Wuhan Institute of Virology ( Kina ) har utvecklat ett DNA-vaccin mot en av orsakerna till karies- Streptococcus mutans . Vaccinet är baserat på en plasmid och kodar för två proteiner: ytproteinet St. mutans PAc och flagellin , härrörande från bakterien Salmonella , som fungerar som ett adjuvans [60] . Vid prekliniska studier administrerades vaccinet genom näsan till laboratoriegnagare, varefter nivån av immunglobuliner G i blodserum och sekretoriska immunglobuliner A i saliv kontrollerades hos djur . Efter studierna fann forskarna att nivån av immunproteiner i både blod och saliv ökade, men, ännu viktigare, tillväxten av Streptococcus mutans-kolonier på tandemaljen hämmades. Det vill säga, tänderna på vaccinerade djur var bättre skyddade mot karies.
Typ 1-diabetes mellitus kännetecknas av förlusten av insulinproducerande betaceller , belägna i bukspottkörtelns öar i Langerhans . Den främsta orsaken till förlust av betaceller är autoimmun skada av mördar-T-celler [61] . För att skydda betaceller från ett överaktivt immunsystem utvecklade forskare från universiteten Stanford ( USA ) och Leiden ( Nederländerna ) DNA-vaccinet BHT-3021. Vaccinet skapades på basis av en plasmid och kodar för prekursorn till insulin -proinsulin . Detta är ett vaccin med omvänd verkan: om konventionella vacciner är tänkta att aktivera immunsvar, så neutraliserar BHT-3021 tvärtom den cytotoxiska effekten av T-dödare riktade mot de Langerhanska öarna.
I den första fasen av kliniska prövningar visade BHT-3021 sin effektivitet i en grupp på 80 personer. Hälften av dem fick intramuskulära injektioner av BHT-3021 var sjunde dag i 12 veckor, och den andra hälften fick placebo . Efter slutet av denna period visade gruppen som fick vaccinet en ökning av nivån av C-peptider i blodet, vilket indikerar återställandet av betacellernas funktion. Inga allvarliga biverkningar registrerades hos någon av deltagarna. Effekten av vaccinet bibehölls i 2 månader [62] .